合成生物學在微生物傳感器中的應用

施冬艷，何珣，陳怡露

(南京工業大學生物與制藥工程學院，江蘇南京 210009)

生物傳感器［1］起源于20世紀中期，1962年Clark等［2］提出了把酶與電極結合來測定酶底物的設想，1967年Updike和 Hicks［3］研制出世界上第一支葡萄糖氧化酶電極，標志著生物傳感器的誕生。生物傳感器是一種精密的分析器件，它結合了一種生物或生物衍生敏感部件(如組織、微生物細胞、細胞器、細胞受體、酶、抗體、核酸等)與一只理化換能器(如電化學電極、光學檢測部件、氣敏電極、熱敏電阻等)，能夠產生間斷或連續的數字電信號，信號強度與被分析物含量成正比，從而對被分析物進行定量和定性的測定。根據生物敏感部件的不同，可以把生物傳感器分類為組織傳感器［4］、微生物傳感器［5-6］、細胞器傳感器［7］、免疫傳感器［8］、酶傳感器［9-10］、DNA 傳感器［11］，其中酶傳感器和微生物傳感器研究得最多，應用也最為廣泛。

微生物傳感器因為其成本低、操作簡便、設備簡單的特點而成為近年來生物傳感器領域研究的熱點，主要應用于生物工業［12-13］、環境監測［5］以及臨床醫學［14-15］等領域。謝佳胤等［16］曾指出，生物傳感器商品化要具備以下條件:足夠的敏感性和準確性、易操作、價格便宜、易于批量生產、生產過程中進行質量監測。表1比較了各種生物傳感器選擇性、穩定性等多項性能。

由表1可以看出，微生物傳感器最大的優點是成本低、操作簡便、設備簡單，相比其他生物傳感器具有獨特的可取之處，因此其市場前景十分巨大和誘人。

表1 各種生物傳感器的性能對比Tab 1 The properties of all kinds of biosensor

作者擬通過分析目前微生物傳感器的研究手段和遇到的問題，探討合成生物學這一新興交叉學科在研究微生物傳感器中的應用，并通過對應用實例的分析闡述其研究思路和發展前景。

1 微生物傳感器

1.1 概念及原理

微生物傳感器［17］是生物傳感器的一個重要分支，它使用微生物活細胞或細胞碎片作為敏感材料，利用其體內的各種酶系及代謝系統來測定和識別被分析物，原理見圖1。

如圖1所示，微生物傳感器的一般原理大致可以分為3種情況:(1)樣品中的物質會誘導啟動微生物細胞中特定的啟動子，進而使得報告基因轉錄、翻譯成可被檢測的報告蛋白;(2)微生物與底物作用，在同化樣品中有機物的同時，微生物細胞的呼吸活性有所提高，反應中會消耗氧或生成二氧化碳，兩者都是可檢測物質;(3)微生物與底物作用后生成各種可檢測到的電極敏感代謝產物。在微生物數量和活性保持不變的情況下，它消耗的溶解氧量或所產生的電活性物質、二氧化碳、報告蛋白的量反映了被檢測物質的量，再借助氣體敏感膜電極(如溶解氧電極、氨電極、二氧化碳電極等)或離子選擇電極(如pH玻璃電極等)以及微生物燃料電池檢測出溶解氧和二氧化碳、電活性物質、報告蛋白的變化，便能得出待測物質的量。

圖1 微生物傳感器工作原理示意圖Fig 1 Principle of microbial sensor

1.2 微生物傳感器研究面臨的困難

微生物具有價格低廉、無需考慮輔助因素、微生物成分可再生等優點，尤其適用于發酵控制和需群酶順序作用的反應。但是目前微生物傳感器的制備仍然存在許多困難與不足之處，限制了它的進一步市場化［18］。如:(1)由于微生物細胞中含有多種酶，可同時對多種底物響應而產生干擾，使得微生物傳感器的選擇性不盡如人意，響應時間比酶傳感器要長［19］;(2)用于環境監測時測定對象中的毒害因素如重金屬和有毒有機物是影響微生物壽命的關鍵因素［20］，也是微生物傳感器市場化的主要控制因素，但是目前篩選天然抗性菌株的工作量很大，且具有盲目性和局限性;(3)環境中污染物的數量越來越多，而目前構建的報告菌株的廣譜性還遠遠不夠;(4)由于微生物細胞保，輸方式也有待改進。

為了解決上述問題，使微生物傳感器能得到更好的應用和推廣，需要更具創新性的理念和技術，特別是交叉學科的研究。合成生物學，這一曾被《Nature》雜志譽為是“將生物領域基礎研究轉化為實際社會生產力，連接基礎學科與實際應用學科的高科技領域”［21］，是近年來生物技術領域備受矚目的新興學科。合成生物學正是以設計合成人工基因組并制造出具有指定功能可自我繁殖的活細胞，完成或優化自然細胞所不能完成的任務為目標，有望為微生物傳感器目前遇到的局限和困難提供創新性的解決辦法［22-23］。

2 合成生物學

2.1 簡介

2009《 · 》 “Focus on Synthetic Biology”的合成生物學專輯［24］，包括社論、進展綜述、前景展望、產業發展、專利產權、政府監管等16篇論文。社論指出:合成生物學通過計算機設計，用4種化學品(A、G、T和C 4種核苷酸)進行基因合成，然后“即插即用”到具有最小化基因組的底盤生物中，可以想象我們在將來能夠毫不費力地創造不同形式的生命，這項突破性的技術具有改變生物工程的潛力。與基因工程把一個物種的基因延續、改變并轉移至另一物種不同，合成生物學的目的在于建立人工生物體系，讓它們像電路一樣運行。

合成生物學領域有3大內容和目標:(1)有別于以往拆解生命的方式，其借由建構生命來了解生命，合成基因組簡化的“底盤微生物”［25］;(2)將基因工程、代謝工程等所使用的部件標準化［26］，使其能與現有系統相結合，創造出更多功能更復雜的系統;(3)成為跨領域的交叉學科，將分子生物學、基因工程、計算機領域的系統設計和系統控制理論、統計學、信息學等應用到生物系統，開拓重組生物與工程的交集，產生真正可由程式控制的生物。

合成生物學發展的主要歷程如表2所示。

表2 合成生物學主要發展歷程Tab 2 The main development of synthetic biology

2.2 應用前景

基因工程注重重組DNA技術的產業化設計與應用，包括上游技術和下游技術兩大組成部分。上游技術包括基因重組、克隆和表達的設計與構建(即重組DNA技術);下游技術則涉及基因工程菌或細胞的大規模培養以及基因產物的分離純化過程。

而合成生物學的目標，則是試圖采用從自然界分割出來的標準生物學部件(可被修飾、重組乃至創造)，進行理性(設計)的重組(乃至從頭合成)以獲得新的生命(生物體)。

目前合成生物學應用最典型的例子就是Keasling研究小組合成青蒿素，他們對青蒿基因及其代謝途徑進行了設計組裝與精密調控，使得大腸桿菌及酵母細胞合成青蒿酸(青蒿素前體)的能力提高了幾個數量級，大幅降低了青蒿酸的生產成本［29］。另外，MIT化工系Gregory研究組［32］運用合成生物學手段利用大腸桿菌合成紫杉醇，他們把紫杉醇代謝途徑分成大腸桿菌固有的異戊烯焦磷酸上游模塊和異源的萜類化合物

，水平，最終使得紫杉二烯(紫杉醇的前體物)產量較改造前提高了15 000倍。

合成生物學在其他領域也都具有不錯的應用前景，包括新藥研發和改進藥物［33］、生物基產品制造［34-35］、可再生和可持續能源的利用［36］、環境污染的生物治理以及用于環境中檢測有毒化學物質的生物傳感器［37-38］等。

2.3 生物安全

合成生物學雖具有巨大的生命力和廣闊應用前景，但隨著這個領域的發展，合成生物學的安全性問題也越來越多，包括致病感染性疾病的威脅［39］、生態平衡的破壞［40］以及倫理、法律［41］等。我們在看到合成生物學的美好前景的同時，也要認真應對這些潛在風險［42］，制定并完善合成生物學法規體系與管理制度，預防惡意的行為，周到地考慮對人類、其他物種、自然界環境的影響。

2010年美國生物倫理研究委員會發表了《新方向:合成生物學和新出現技術的倫理》的研究報告［43］、 、可。《自然》、《科學》等雜志，《紐約時報》等媒體，“生物工業組織”等產業協會也作出了積極的反應。這些都為合成生物學的發展提供了極好的氛圍和機會。在各國相關法規約束以及各國科學家自身努力下，合成生物學一定會得到更快、更健康的發展。

2.4 合成生物學在微生物傳感器中的應用

2.4.1 應用思路 就合成生物學的研究內容和目標，我們可以看出其技術思路有望突破目前微生物傳感器研究中遇到的一些局限，為微生物傳感器的發展作出新貢獻［44-45］，比如說:

(1)相關領域的研究者們一直在尋找選用能對污染物起響應的更加特異和有效的新調控部件［46-47］，在未來我們可以運用這些生物部件提高微生物傳感器的靈敏性。

最小基因組的研究也給微生物傳感器帶來了新的進展，最小基因組可以減少背景噪音，提高微生物傳感器的選擇性。而提高微生物傳感器的靈敏性和選擇性都能減少響應時間。

(2)對環境中的有毒有機物，我們可以找到相關的酶并對其進行強表達，將解毒和報告結合起來，既解除環境中有毒物質對微生物細胞的生存危害又能檢測到有毒物。

(3)為了解決保存和運輸的問題，我們可以嘗試選用孢子微生物，然后用孢子作為微生物傳感器的保存形式［38，48］。

(4)合成生物學的思路是將“基因”或者生物部件連接成網絡。我們可以嘗試將兩個報告基因這樣的部件組裝在一起形成雙報告基因，這樣可以拓寬微生物工程菌株的檢測范圍，提高傳感器的廣譜性和方便性。

2.4.2 應用實例 目前，國際上已經開展了應用合成生物學開發微生物傳感器的相關研究，其中一個例子就是愛丁堡大學的Joshi研究小組設計和構建出的一種能夠監測水中砷含量的工程菌［38］。而在愛丁堡大學之前已有許多研究者從酶學和生物學的角度對砷檢測進行了研究。其中一種方法是用乙酰膽堿酯酶(Ach)做成的電極來感應砷，Sanllorente-Mendez等［49］用該法研究出可以檢測到1.1×10-8mol·L-1砷的Ach/SPCE生物傳感器，雖然這一研究很成功，但是4℃的保存條件使得這一裝置很難運輸。而Sarkar等［50］將L-半胱氨酸用聚丙烯酰胺固定在工作的電極上，以此來檢測砷濃度，砷的檢測濃度低至1～30 μg·L-1且和信號呈線性關系。但是，該裝置中昂貴的鉑電極為這一裝置的商業化帶來很大的困難［51］。而微生物傳感器為這些問題的解決提供了可能性［52］。Tani等［53］利用帶有ars啟動子和gfp的重組大腸桿菌制成了一種微生物傳感器系統，但該裝置需要紫外系統來讀出結果，限制了它的方便性。而Yoshida等［54］運用一種光合細菌Rhodopseudomonas palustris作為出發菌株，該菌在響應砷污染物時會發生肉眼可見的顏色變化，但該結果只起到了定性的作用。上述研究雖頗有成就，但是還不能滿足一個優良的微生物傳感器所需的條件，即成本低、簡單、保存方便、高選擇性、可在貧困地區使用等。愛丁堡大學的研究成果突破了原先的局限，為微生物傳感器的發展打開了新局面。

愛丁堡大學的Joshi利用具有感知水中砷離子功能的啟動子，設計了相應的微生物傳感器。該啟動子在有砷離子存在的情況下能改變細胞的代謝反應，并最終改變溶液的pH。利用微生物作為檢測器，不僅可以大大降低成本，且較之其他砷離子檢測器而言，利用pH的變化作為砷離子存在與否的信號很容易被pH檢測儀甚至更方便的pH試紙檢測到，使儀器的實用性得到極大的提高［38］。

該砷離子生物檢測系統［55］如圖2所示，整個系統只有在砷離子或乳糖存在時才有響應。裝置1中的啟動子3為組成型常開啟動子，下游lacI基因表達的產物LacI抑制啟動子4的啟動。

圖2 砷傳感器示意圖Fig 2 The sketch map of arsenic biosensor

(1)當環境中只有乳糖存在而無砷離子存在時，乳糖與LacI結合，解除LacI對啟動子4的抑制，啟動子4順利啟動，其下游的尿素酶基因表達產生尿素酶。尿素酶催化尿素轉化為氨和二氧化碳，環境的pH升高，其值約為9～10。

(2)當環境中的砷離子濃度較低(如5 μg·L-1)時，響應低濃度砷離子的高敏感裝置2啟動。砷離子與ArsR結合，解除其對啟動子2的抑制，下游的λcI基因順利表達，產生的CI蛋白抑制裝置1的啟動子4，關閉尿素酶基因的表達，阻止其對尿素的催化作用。此時由于沒有相應酸或堿的產生，系統的pH維持在中性狀態(由于少量殘余尿素的存在，pH可能會略高于中性)，即pH約為7。

(3)當環境中砷離子濃度較高(如20 μg·L-1)時，響應高濃度砷離子的裝置3啟動。砷離子與ArsD結合，解除其對啟動子1的抑制，下游的lacZ基因順利表達，lacZ基因編碼的β-半乳糖苷酶催化乳糖的發酵，使其分解為乙酸和乳糖酸，此時pH約為4.5。最終通過溴百里酚藍顯色劑顯色來顯示不同的pH。如圖3所示。該模型不但達到了半定量的水平，可區分無砷、低濃度砷、高濃度砷3種狀態，而且可以用細胞凍干粉和風干的細胞作為保存方式，且常溫下保質期至少為幾周，極大提高了保存和運輸的方便性。

圖3 溴百里酚藍作為pH指示劑的砷分析Fig 3 Arsenic assays conducted with bromthymol blue as pH indicator

愛丁堡大學的研究成果無疑給合成生物學領域注入了一支強心劑，不僅證明了合成生物學的研究思想是可行的，還顯示出了合成生物學的獨特優勢。現在合成生物學正在發展階段，還有很多問題需要解決，但是我們相信隨著技術的不斷成熟，合成生物學定能為人類作出不可小覷的貢獻。

3 發展前景

微生物傳感器由于酶源豐富且穩定、周期短成本低、應用廣泛等優點一直是相關領域研究的熱點，而快速發展的合成生物學手段能較好地彌補目前微生物傳感器的缺陷，進一步推進微生物傳感器的研究發展。未來必將是交叉學科發揮作用的時代，微生物傳感器和合成生物學的結合定能為這一領域帶來突破性的進展，從而造福人類。

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