染色質免疫沉淀分析胰島β細胞中TCF7L2與GPR40的結合*

畢健琨，任 偉,鄭曉雅,許 丹

(重慶醫科大學附屬第一醫院內分泌科 400016)

2型糖尿病(T2DM)屬于復雜的多基因疾病，遺傳因素與環境因素共同參與發病過程。2006年首次報道TCF7L2，即T細胞轉錄因子-4(TCF-4)單核苷酸多態性與T2DM顯著相關[1]，Weedon等[2]認為TCF7L2 rs7903146位點基因變異型是目前發現的和T2DM發病風險相關性最強的基因型。隨后在多范圍大樣本的研究中得到類似的結果。TCF7L2位于染色體10q25.3，表達產物是高遷移率(HMG)組盒包含的1個轉錄因子。TCF7L2是T細胞因子/淋巴細胞增強子結合因子(TCF/LEF)之一。

GPR40是G蛋白偶聯受體家族(GPCRs)成員之一。它在腦、胰腺、肝、心臟、骨骼肌等均有表達[3-4]，尤其在胰島、腦組織中表達豐富。GPR40是脂肪酸的特異性受體，脂肪酸作為胞外配體，活化GPR40，激活胰島β細胞內信號轉導途徑，調節胰島素分泌。GPR40在脂肪酸增強GSIS和促進胰島β細胞過度增殖，進而在引起胰島β細胞功能缺陷中扮演重要角色。2007年，Reut等[5]發現GPR40與轉錄因子PDX-1存在特異性結合位點，但是GPR40是否與轉錄因子TCF7L2存在結合位點，目前尚不清楚。

在后基因組時代，DNA-蛋白質的相互作用是研究基因表達調控的重要領域。染色質免疫沉淀技術(chromatin immunoprecipitation，CHIP)，是一種在體內研究DNA-蛋白質相互作用的理想方法，利用抗原抗體反應的特異性以及PCR的高靈敏性，可以真實地反映體內蛋白因子與基因組結合的狀況，已成為染色質水平基因表達調控研究的最有效方法。本研究擬通過CHIP技術探討GPR40蛋白與TCF7L2基因是否存在相互作用。

1 材料與方法

1．1材料

1．1．1細胞株 胰島βTC6細胞購買于中國科學院細胞庫。

1．1．2主要試劑和儀器 PAA胎牛血清(德國德圖)，DMEM高糖培養基(美國Gibco公司)，TCF7L2的抗體為兔抗人TCF7L2單克隆抗體C9B9(美國Cell signaling technology)，PCR引物由上海生工生物工程技術服務公司合成。CHIP試劑盒為美國Millipore公司magna chipTMA。超聲破碎儀為美國Sonic公司VC750型，PCR儀為美國MJ公司 PTC-200型。

1．2方法

1．2．1胰島βTC6細胞的培養及細胞的甲醛交連 胰島βTC6細胞用含20%的胎牛血清的DMEM高糖培養液在37 ℃，5%CO2飽和濕度條件下培養，2 d換液，7 d傳代1次。實驗時取對數生長期細胞。取1培養皿細胞(10 cm培養皿)，吸掉培養皿中的培養基，加入10 mL 1%甲醛，37 ℃孵育10 min。加入1.25 mol/L甘氨酸1 mL，至終濃度為125 mmol/L，室溫下放置2 min。棄上清液，用1 mL冷PBS刮細胞，移至1.5 mL的EP管中，2 500 r/min離心5 min，棄上清，加入800 μL PBS，4 ℃預冷15 min，然后4 ℃ 2 500 r/min離心5 min，重復PBS清洗1遍。然后用包含10 mmol/L HEPES pH7.5，10 mmol/L EDTA，0.5 mmol/L EGTA，0.75% Triton X-100的溶液清洗細胞一遍，再用包含10 mmol/L HEPES pH7.5，200 mV Nacl，1 mmol/L EDTA,0.5 mmol/L EGTA的溶液清洗細胞一遍。

1．2．2超聲破碎 在樣品中加入1 mL的lysis buffer(150 mmol/L Nacl 1% Triton X-100,25 mmol/L Tris pH7.5,0.1%SDS,0.5%脫氧膽酸鹽),充分混勻，超聲震蕩，30%功率震蕩強度(10 s+60 s)×10次，4 ℃ 2 500 r/min離心5 min，取上清，測蛋白濃度。

1．2．3檢驗超聲破碎效果 取100 μL超聲破碎后產物，加入4 μL 5 mol/L NaCl，65 ℃處理2 h解交聯。分出一半用氯仿抽提。電泳檢測超聲破碎后的效果。

1．2．4免疫沉淀 取200～500 μg蛋白，加入80 μL蛋白A瓊脂糖/鮭精DNA，室溫下放置30 min。4 ℃ 2 500 r/min離心5 min，留蛋白上清總體積的10% 作為input，然后將剩余上清分成2份，分別加目的TCF7L2抗體、陽性對照乙酰化組蛋白H3抗體和陰性對照IgG。4 ℃ 150 r/min放搖床過夜。次日早晨，每樣品加入60 μL蛋白A瓊脂糖/鮭精DNA，4 ℃放置4 h，4 ℃ 2 500 r/min離心5 min，棄上清液。每管加入500 μL RIPA buffer(150 mmol/L Nacl，50 mmol/L Tris-HCl pH8，0.1% SDS，0.5% Deoxycholat，1 mmol/L EDTA，1% NP-40)，4 ℃放置15 min，4 ℃ 2 500 r/min離心5 min，棄上清液。分別用預冷high salt buffer(50 mmol/L Tris-Hcl pH8，0.1% SDS，0.5% Deoxycholate，1 mmol/L EDTA，1% NP-40，500 mmol/L Nacl)和LiCl buffer(50 mmol/L Tris-Hcl pH8，250 mmol/L Licl，0.1% SDS，0.5% Deoxycholate，1% NP-40，1 mmol/L EDTA)洗膠一遍，用預冷TE buffer(10 mmol/L Tris，1 mmol/L EDTA)洗膠2遍，棄上清液。

1．2．5蛋白質/DNA復合物的洗脫及DNA的去交聯 向膠中加入250 μL Elution buffer(1% SDS，0.1 mol/L NaHCO3)，室溫放置15 min，2 500 r/min離心5 min，轉移上清液至新EP管，重復洗一遍。取上清液(500 μL)于新EP管，加20 μL Nacl(5 mol/L)，混勻，input加Elution Buffer補體積至500 μL，再加20 μL Nacl(5 mol/L)(如：100 μL input+4 μL Elution Buffer+20 μL 5 mol/L Nacl)一起65 ℃水浴過夜。取出置室溫，加入2 μL ProteinaseK(10 mg/mL)，45 ℃水浴1 h。加入等體積(520 μL)氯仿，劇烈震蕩10 s，室溫，12 000 r/min離心1 min，將含DNA上層400 μL移入新管中，加1/10體積即40 μL 3 mol/L乙酸鈉，稍加震蕩，加2體積即800 μL 100%預冷乙醇，加1 μL(20 μg) 糖原，震蕩混勻，置-30 ℃過夜，充分沉淀DNA。12 000 r/min離心10 min。加入1 mL 70% 乙醇，混勻，12 000 r/min離心5 min，棄上清液，室溫干燥至少30 min。加入dH20 50～100 μL， 65 ℃水浴至少30 min。洗脫后的DNA即可進行PCR檢測。

1．2．6PCR及瓊脂糖凝膠電泳檢測 設計GPR40基因引物為5′-CTC ACA GTC CTC CCA GGG TC-3′，5′-CTT CAG TGC GAC ATC GTC TT-3′，預計擴增長度為155 bp。擴增體系為10 μL，PCR Mix 5 μL，超純水3 μL，DNA模板1 μL，上游引物0.5 μL，下游引物0.5 μL。擴增條件，94 ℃預變性2 min，94 ℃變性30 s，59 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，25個循環后72 ℃延伸7 min。PCR反應結束后，取4 μL擴增產物進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析，觀察并分析結果。

2 結 果

2．1胰島βTC6細胞株核染色質切割有效性的確定 為了得到合適大小的DNA片段，摸索了不同的超聲功率，超聲時間的超聲破碎條件，最終得到了合適的條件，使得DNA片段長度為100～1 000 bp(圖1)。

2．2TCF7L2抗體免疫沉淀DNA模板的PCR擴增結果檢測 陽性對照乙酰化組蛋白H3抗體免疫沉淀的DNA為模板，陰性對照以IgG抗體免疫沉淀的DNA為模板，陽性對照條帶清晰明亮。而陰性對照看不見擴增產物。結果說明實驗中沉淀可信。以TCF7L2抗體免疫沉淀的染色質片斷提取的DNA為模板，PCR擴增GPR40，結果顯示模板中含有被擴增區段的DNA(圖2)。

1：對照(未超聲破碎);2、3：超聲打斷后的染色質。

1：乙酰化組蛋白H3抗體免疫沉淀的DNA;2：TCF7L2抗體免疫沉淀的DNA;3：羊抗人IgG抗體免疫沉淀的DNA;4：DEPC水;M:DNA Marker。

3 討 論

染色質免疫沉淀技術是基于體內分析發展起來的方法，已經成為表觀遺傳信息研究的主要方法。它能夠較真實地反映體內狀態下染色質與基因轉錄調控因子的結合情況[6]。這種方法與DNA芯片與分子克隆技術相結合，可用于高通量的篩選已知蛋白因子的未知DNA靶點和研究反式作用因子在整個基因組上的分布情況，這將有助于深入了解DNA-蛋白質相互作用的調控網絡[7]。

染色質免疫沉淀技術雖然在基因表達調控中發揮了越來越重要的作用，但是該技術操作繁瑣、復雜，實驗操作對實驗結果影響較大，其中DNA片段的大小對實驗結果起著較大的影響[8]。DNA片段較大，不利于區分染色質上結合有目的蛋白和沒有結合目的蛋白的區域，DNA片段較小不利于PCR擴增。因此，適當的DNA片段大小對于染色質免疫沉淀的結果非常重要，一般認為100～1 000 bp的長度范圍是比較合適的。此外，用于染色質免疫沉淀的抗體的質量直接決定實驗的成敗，一般用于免疫組化和Westeren blotting的抗體不適合用于做染色質免疫沉淀，染色質免疫沉淀需要更高特異性的抗體。抗體的用量也特別重要，抗體用量過多可能會沉淀某些非特異性蛋白，抗體用量過少則特異蛋白沉淀不完全，適宜的抗體量是剛好沉淀經超聲剪切的特異性蛋白[9]。只有優化各種實驗條件，才能得到較滿意的染色質免疫沉淀的實驗結果。

胰島β細胞通過分泌適量的胰島素來維持機體的需要，這對保持機體的代謝平衡起到了決定性的作用。胰島素的分泌主要取決于血糖的波動，同時，營養因素，神經傳導作用以及激素的相互作用均對胰島素的分泌產生影響[10]。為了實現其重要的生理作用，胰島β細胞對某些在該細胞中選擇表達的基因進行調控，對這些基因的調控是通過轉錄控制機制來完成的[11]，這涉及普遍存在的整合機制以及細胞的轉錄因子[12]。GPR40基因選擇性地表達在胰島β細胞，它對胰島素分泌起到了重要作用。

研究證實TCF7L2與GPR40與T2DM顯著相關。轉錄因子TCF7L2可以通過改變Wet信號途徑來直接影響胰島β細胞的生物學功能，而且TCF7L2也可以間接引起腸胰島軸的功能缺陷，包括GLP-1的分泌減少和GLP-1所誘導的胰島素分泌缺陷和(或)功能障礙。但是，GPR40是通過何種途徑調節胰島素的分泌以及胰島β細胞功能目前尚不清楚。Del Guerra等[13]研究發現脂肪酸調節了人類胰島中的GPR40的表達，T2DM患者胰腺中的GPR40的表達量較正常人少，胰島素的分泌以及胰島β細胞功能的異常均與GPR40有關。Kebede等[14]認為GPR40不僅能夠在脂肪酸刺激的胰島素分泌中起作用，而且在高脂飲食的情況下對葡萄糖刺激的胰島素分泌也起作用。Naqasumi等[15]研究發現GPR40可以調節葡萄糖刺激的胰島素分泌以及體內的血漿葡萄糖水平，同時可以提高普通小鼠以及糖尿病小鼠的糖耐量。Thierry等[16]研究發現GPR40的缺失可以降低胰島素的分泌，其機制并不是通過影響脂肪酸刺激的胰島素分泌，而是減少了葡萄糖以及精氨酸刺激的胰島素分泌，其機制是通過影響肌醇磷酸類的產生。Pang等[17]則認為GPR40介導的胰島素的分泌，部分是由于刺激了腎上腺素受體所引起的。然而GPR40基因啟動子是否與轉錄因子TCF7L2相互結合，從而影響胰島素的分泌，目前未見相關報道。

已經證實GPR40與轉錄因子PDX-1存在特異性結合位點。為了探討轉錄因子TCF7L2是否對GPR40基因直接起作用，本研究以TCF7L2抗體免疫沉淀TCF7L2結合的染色質片段，PCR擴增出GPR40基因，該結果證實TCF7L2可與GPR40基因調控區結合，為TCF7L2參與GPR40表達調控提供了強有力的證據。本研究為GPR40如何參與胰島素分泌找到了新的依據。但是TCF7L2是如何參與GPR40表達調控還需進一步研究。

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