酶育牛黃對肉瘤S180的抑制作用及免疫調節作用的初步研究

劉化俠 魏寅翼 胡曉旭 萬學英 李 蕾

(泰山醫學院護理學院，山東 泰安 271016)

天然牛黃 (natural calculus bovis, NCB) 是珍貴的中藥材，主要含膽汁酸、膽色素、肽類物質、氨基酸、多種微量元素及維生素D和類胡蘿卜素等多種活性物質。研究顯示其具有良好的解熱鎮痛、抗腫瘤和免疫增強作用[1]，但機制未明。由于天然牛黃資源奇缺，價格昂貴，因此研發天然牛黃的替代品是解決資源不足的主要途徑之一。酶育牛黃(culculus bovis cultivated by glucuronidase, CBCG)是泰山醫學院自行研制的一種在體外培育的牛黃[2]，高效液相電化學法(HPLC) 檢測發現其膽紅素含量明顯高于天然牛黃， 膽酸類成分與天然牛黃相當；HPLC-ELSD指紋圖譜進一步證實制備工藝穩定。初步研究發現酶育牛黃在抗炎、解熱鎮痛方面的藥理效應與天然牛黃相當。本實驗旨在初步探討酶育牛黃的抗腫瘤及免疫調節作用，為酶育牛黃抗腫瘤的深入研究提供理論依據。

1 材料和方法

1.1材料 動物：昆明種小鼠50只，體重20～26 g，清潔級。動物合格證號：0011932。小鼠標準顆粒飼料喂養，由泰山醫學院實驗動物中心提供。 藥品： CBCG：由泰山醫學院周廣禮教授提供。注射用環磷酰胺：山西普德藥業股份有限公司，批號：04110605。肉瘤S180細胞：上海博全爾生物科技有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1體內實驗

1.2.1.1牛黃混懸液的制備 取淀粉1 g加入100 ml蒸餾水，煮沸，室溫冷卻。加入適量CBCG，即得酶育牛黃混懸液。

1.2.2體外實驗

1.2.2.1含藥血清的制備 取Wistar大鼠8只，雌雄各半，每天分別灌胃給予牛黃混懸液2 g/kg或腹腔注射CTX 20 mg/kg，連續7天，最后一次給藥后2小時，水合氯醛麻醉，心臟取血，無菌分離血清，56℃、30 min滅活，-20℃保存備用。

2 結 果

2.1體內實驗

2.1.1酶育牛黃對小鼠肉瘤S180的體內抑制作用 從表1可以看出，模型組小鼠體內腫瘤的平均瘤重明顯增加；連續給予酶育牛黃10天劑量依賴性地抑制腫瘤生長，中劑量和高劑量組明顯使平均瘤重減輕，與模型組相比，差異具有顯著性。環磷酰胺組的抑瘤率達到74.24%，顯示出較好的抑瘤作用。

表1 酶育牛黃對小鼠肉瘤S180的體內抑制作用(n=10)

注：與模型組比較，***P<0.001。

2.1.2CBCG對免疫器官的影響 與模型組比較，酶育牛黃各組脾和胸腺指數均有所增加，且呈現劑量依賴，其中高劑量組能夠明顯提高免疫器官重量，與模型組相比，差異具有顯著性。環磷酰胺組，脾指數及胸腺指數均有所降低，結果見表2。

表2 酶育牛黃對小鼠免疫器官的影響(n=10)

注：與模型組比較，***P<0.001，###P<0.001。

2.2體外實驗

2.2.1CBCG含藥血清對S180的生長抑制作用 酶育牛黃含藥血清處理24或48小時，肉瘤S180細胞生長受到抑制，其作用隨含藥血清濃度的增加而增強。10%、20%、30%酶育牛黃組和10%環磷酰胺組效果尤為明顯，與對照組比較，具有顯著性差異，結果見圖1，2。

注：與對照組比較，***P<0.001。

圖1 CBCG含藥血清作用24小時抑制S180細胞增殖率

注：與對照組比較，*P<0.05 ,**P<0.01,***P<0.001 。

圖2 CBCG含藥血清作用48小時抑制S180細胞增殖率

2.2.2CBCG含藥血清對脾細胞的促增殖作用 酶育牛黃含藥血清作用24或48小時可促進脾細胞增殖，且其增殖程度與血清濃度、作用時間呈正相關。7.5%、10%、20%、30%酶育牛黃組效果明顯，與對照組比較，具有顯著性差異。環磷酰胺組對脾細胞增殖具有抑制作用，結果見圖3，4。

注：與對照組比較，***P<0.001。

圖3 CBCG含藥血清作用24小時促脾細胞率

注：與對照組比較，**P<0.01,***P<0.001。

圖4 CBCG含藥血清作用48小時促脾細胞率

3 討 論

惡性腫瘤是二十一世紀人類健康的第一殺手。目前對惡性腫瘤的治療還沒有特效藥，從中藥復方或制劑中開發研制新的抗腫瘤藥成為惡性腫瘤治療的重要課題之一。牛黃常被制成復方制劑如犀黃丸(西黃丸)等, 用于各種惡性腫瘤如肝癌的治療。研究發現，牛黃和人工牛黃都有增強免疫和抗腫瘤的作用，抑瘤率在30%～72.2.%[1，3-4]。但目前對牛黃及其復方制劑的抗腫瘤研究主要集中在體內實驗和臨床研究，對體外及細胞的抗腫瘤研究鮮有報道。而且，牛黃復方制劑產生的抗腫瘤作用是否來自于多種成分的復合效應還是單純牛黃的作用也未見報道。 本研究主要從免疫機制著手，探討我們自主研制的酶育牛黃在小鼠體內的抗腫瘤作用，同時采用體外細胞實驗初步探討其作用機制。

研究結果顯示：酶育牛黃在小鼠體內外均呈現較好的抗腫瘤作用，酶育牛黃高劑量組對抑瘤率的影響超出了“抗癌藥體內藥效試驗規程”所限定的30%標準[5]。酶育牛黃組抑瘤率雖略低于陽性對照藥組，但其未出現環磷酰胺組的免疫抑制作用，相反其促進免疫器官代償性增大(圖3,4)。本研究的體外實驗結果進一步驗證了體內實驗的結果。由此可見，酶育牛黃不僅具有良好的抑制瘤細胞增殖的作用，同時具有促進免疫細胞增殖的作用。本研究為酶育牛黃的抗腫瘤機制的深入研究提供了研究基礎，也為開發新型抗腫瘤藥提供了理論依據。

[1] 遲程，遲萍. 中國牛黃43年(1949-1992)研究動態[J]. 中國民族民間醫藥雜志，1996,18(1):27-35.

[2] 周廣禮，張豐雪，朱長義.以大腸桿菌B-葡萄糖醛酸酶培育牛黃實驗研究[J]. 泰山醫學院學報，1991,12(1):13-14.

[3] 田彥玲，劉京生.牛黃天龍方藥對荷瘤小鼠免疫功能的影響及其抗腫瘤作用的實驗研究[J].河北醫藥，2009,31(23)：3184-3185.

[4] 汪世元，陳孝平，蔡紅嬌，等.外培育牛黃誘導人肝癌HepG2細胞凋亡的實驗研究[J].華中科技大學學報：醫學版，2005，34(6)：754.

[5] 潘啟超.腫瘤藥理學及化學治療學[M].廣州：廣東高等教育出版社,1989:432.