酶育牛黃對肉瘤S180的抑制作用及免疫調(diào)節(jié)作用的初步研究

劉化俠 魏寅翼 胡曉旭 萬學(xué)英 李 蕾

(泰山醫(yī)學(xué)院護(hù)理學(xué)院，山東 泰安 271016)

天然牛黃 (natural calculus bovis, NCB) 是珍貴的中藥材，主要含膽汁酸、膽色素、肽類物質(zhì)、氨基酸、多種微量元素及維生素D和類胡蘿卜素等多種活性物質(zhì)。研究顯示其具有良好的解熱鎮(zhèn)痛、抗腫瘤和免疫增強(qiáng)作用[1]，但機(jī)制未明。由于天然牛黃資源奇缺，價格昂貴，因此研發(fā)天然牛黃的替代品是解決資源不足的主要途徑之一。酶育牛黃(culculus bovis cultivated by glucuronidase, CBCG)是泰山醫(yī)學(xué)院自行研制的一種在體外培育的牛黃[2]，高效液相電化學(xué)法(HPLC) 檢測發(fā)現(xiàn)其膽紅素含量明顯高于天然牛黃， 膽酸類成分與天然牛黃相當(dāng)；HPLC-ELSD指紋圖譜進(jìn)一步證實制備工藝穩(wěn)定。初步研究發(fā)現(xiàn)酶育牛黃在抗炎、解熱鎮(zhèn)痛方面的藥理效應(yīng)與天然牛黃相當(dāng)。本實驗旨在初步探討酶育牛黃的抗腫瘤及免疫調(diào)節(jié)作用，為酶育牛黃抗腫瘤的深入研究提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1材料 動物：昆明種小鼠50只，體重20～26 g，清潔級。動物合格證號：0011932。小鼠標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料喂養(yǎng)，由泰山醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供。 藥品： CBCG：由泰山醫(yī)學(xué)院周廣禮教授提供。注射用環(huán)磷酰胺：山西普德藥業(yè)股份有限公司，批號：04110605。肉瘤S180細(xì)胞：上海博全爾生物科技有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1體內(nèi)實驗

1.2.1.1牛黃混懸液的制備 取淀粉1 g加入100 ml蒸餾水，煮沸，室溫冷卻。加入適量CBCG，即得酶育牛黃混懸液。

1.2.2體外實驗

1.2.2.1含藥血清的制備 取Wistar大鼠8只，雌雄各半，每天分別灌胃給予牛黃混懸液2 g/kg或腹腔注射CTX 20 mg/kg，連續(xù)7天，最后一次給藥后2小時，水合氯醛麻醉，心臟取血，無菌分離血清，56℃、30 min滅活，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2 結(jié) 果

2.1體內(nèi)實驗

2.1.1酶育牛黃對小鼠肉瘤S180的體內(nèi)抑制作用 從表1可以看出，模型組小鼠體內(nèi)腫瘤的平均瘤重明顯增加；連續(xù)給予酶育牛黃10天劑量依賴性地抑制腫瘤生長，中劑量和高劑量組明顯使平均瘤重減輕，與模型組相比，差異具有顯著性。環(huán)磷酰胺組的抑瘤率達(dá)到74.24%，顯示出較好的抑瘤作用。

表1 酶育牛黃對小鼠肉瘤S180的體內(nèi)抑制作用(n=10)

注：與模型組比較，***P<0.001。

2.1.2CBCG對免疫器官的影響 與模型組比較，酶育牛黃各組脾和胸腺指數(shù)均有所增加，且呈現(xiàn)劑量依賴，其中高劑量組能夠明顯提高免疫器官重量，與模型組相比，差異具有顯著性。環(huán)磷酰胺組，脾指數(shù)及胸腺指數(shù)均有所降低，結(jié)果見表2。

表2 酶育牛黃對小鼠免疫器官的影響(n=10)

注：與模型組比較，***P<0.001，###P<0.001。

2.2體外實驗

2.2.1CBCG含藥血清對S180的生長抑制作用 酶育牛黃含藥血清處理24或48小時，肉瘤S180細(xì)胞生長受到抑制，其作用隨含藥血清濃度的增加而增強(qiáng)。10%、20%、30%酶育牛黃組和10%環(huán)磷酰胺組效果尤為明顯，與對照組比較，具有顯著性差異，結(jié)果見圖1，2。

注：與對照組比較，***P<0.001。

圖1 CBCG含藥血清作用24小時抑制S180細(xì)胞增殖率

注：與對照組比較，*P<0.05 ,**P<0.01,***P<0.001 。

圖2 CBCG含藥血清作用48小時抑制S180細(xì)胞增殖率

2.2.2CBCG含藥血清對脾細(xì)胞的促增殖作用 酶育牛黃含藥血清作用24或48小時可促進(jìn)脾細(xì)胞增殖，且其增殖程度與血清濃度、作用時間呈正相關(guān)。7.5%、10%、20%、30%酶育牛黃組效果明顯，與對照組比較，具有顯著性差異。環(huán)磷酰胺組對脾細(xì)胞增殖具有抑制作用，結(jié)果見圖3，4。

注：與對照組比較，***P<0.001。

圖3 CBCG含藥血清作用24小時促脾細(xì)胞率

注：與對照組比較，**P<0.01,***P<0.001。

圖4 CBCG含藥血清作用48小時促脾細(xì)胞率

3 討 論

惡性腫瘤是二十一世紀(jì)人類健康的第一殺手。目前對惡性腫瘤的治療還沒有特效藥，從中藥復(fù)方或制劑中開發(fā)研制新的抗腫瘤藥成為惡性腫瘤治療的重要課題之一。牛黃常被制成復(fù)方制劑如犀黃丸(西黃丸)等, 用于各種惡性腫瘤如肝癌的治療。研究發(fā)現(xiàn)，牛黃和人工牛黃都有增強(qiáng)免疫和抗腫瘤的作用，抑瘤率在30%～72.2.%[1，3-4]。但目前對牛黃及其復(fù)方制劑的抗腫瘤研究主要集中在體內(nèi)實驗和臨床研究，對體外及細(xì)胞的抗腫瘤研究鮮有報道。而且，牛黃復(fù)方制劑產(chǎn)生的抗腫瘤作用是否來自于多種成分的復(fù)合效應(yīng)還是單純牛黃的作用也未見報道。 本研究主要從免疫機(jī)制著手，探討我們自主研制的酶育牛黃在小鼠體內(nèi)的抗腫瘤作用，同時采用體外細(xì)胞實驗初步探討其作用機(jī)制。

研究結(jié)果顯示：酶育牛黃在小鼠體內(nèi)外均呈現(xiàn)較好的抗腫瘤作用，酶育牛黃高劑量組對抑瘤率的影響超出了“抗癌藥體內(nèi)藥效試驗規(guī)程”所限定的30%標(biāo)準(zhǔn)[5]。酶育牛黃組抑瘤率雖略低于陽性對照藥組，但其未出現(xiàn)環(huán)磷酰胺組的免疫抑制作用，相反其促進(jìn)免疫器官代償性增大(圖3,4)。本研究的體外實驗結(jié)果進(jìn)一步驗證了體內(nèi)實驗的結(jié)果。由此可見，酶育牛黃不僅具有良好的抑制瘤細(xì)胞增殖的作用，同時具有促進(jìn)免疫細(xì)胞增殖的作用。本研究為酶育牛黃的抗腫瘤機(jī)制的深入研究提供了研究基礎(chǔ)，也為開發(fā)新型抗腫瘤藥提供了理論依據(jù)。

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[3] 田彥玲，劉京生.牛黃天龍方藥對荷瘤小鼠免疫功能的影響及其抗腫瘤作用的實驗研究[J].河北醫(yī)藥，2009,31(23)：3184-3185.

[4] 汪世元，陳孝平，蔡紅嬌，等.外培育牛黃誘導(dǎo)人肝癌HepG2細(xì)胞凋亡的實驗研究[J].華中科技大學(xué)學(xué)報：醫(yī)學(xué)版，2005，34(6)：754.

[5] 潘啟超.腫瘤藥理學(xué)及化學(xué)治療學(xué)[M].廣州：廣東高等教育出版社,1989:432.