胰島素樣生長因子-Ⅱ及基質金屬蛋白酶-9與早期自然流產的相關性研究

張旭東 李 麗

(中國人民解放軍第88醫院婦產科，山東 泰安 271000)

早期自然流產(early spontaneous abortion,ESA)占自然流產的80%以上。病因主要有染色體異常、黃體功能不全、解剖因素、免疫功能異常、感染及環境因素等。此外,仍有40%～50%患者流產原因不明[1]。

妊娠是成功的半同種異體移植現象,胚胎植入是一個非常復雜而精細的生物學過程，受多種細胞因子的調節，涉及一系列的信號傳導機制。正常情況下母體與胚胎間存在著復雜而特殊的免疫學關系，滋養細胞在母胎免疫耐受中起著關鍵作用，是母胎界面唯一與母體免疫系統直接接觸的胎兒的外胚層抗原。胚胎植入過程中絨毛外滋養細胞侵襲力降低, 可引起子宮螺旋小動脈重塑異常、不能轉化為低阻力血管,導致胎盤局部缺血缺氧,可能是造成早期自然流產的關鍵因素。

基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs) -9是細胞外基質降解過程中的限速酶。胰島素樣生長因子-Ⅱ(insulin-like growth factor-Ⅱ，IGF-Ⅱ)主要在絨毛小葉的合體滋養細胞、細胞滋養細胞及羊膜絨毛層內表達[2]。研究推測子癇前期發病中IGF-Ⅱ在滋養細胞合成和表達減少,使滋養細胞分泌MMP-9減少, 影響胎盤滋養細胞對螺旋小動脈的逆行浸潤, 使胎盤血流量減少,絨毛間隙含氧量減少,造成絨毛細胞缺血缺氧，導致子癇的發生[3]。

本研究通過檢測早期自然流產患者絨毛中IGF-Ⅱ及MMP-9的表達，旨在明確IGF-Ⅱ和MMP-9的關系及IGF-Ⅱ對MMP-9表達的影響，探討MMP-9在IGF-Ⅱ作用下對基質金屬蛋白酶的降解作用，進一步明確早期自然流產的原因。

1 資料和方法

1.1 研究對象及分組

1.1.1正常妊娠組 選取2011年3月至2011年10月因計劃生育因素自愿到我院計劃生育門診人工流產的早孕婦女20例。標準:(1)年齡在20～35歲之間；(2) 月經規律，停經6～8周，彩超證實為宮內妊娠且見胚芽或胎心搏動；(3)妊娠前3個月及妊娠后未使用過甾體激素，本次妊娠期間無陰道流血、腹痛等先兆流產癥狀；(4) 無死胎、死產及自然流產史，排除子宮畸形、染色體、內分泌及解剖結構等方面的異常及自身免疫性疾病與生殖道感染。

1.1.2自然流產組 選取同一時間不明原因早期自然流產患者30例。標準:(1)年齡在20～35歲之間 ；(2) 月經規律，停經7～10周，兩次彩超檢查(間隔至少1周)均未見胎芽及原始心管搏動； (3)妊娠前3個月及妊娠后未使用過甾體激素；(4)排除絨毛染色體異常；(5)排除子宮畸形、感染及內分泌異常，夫婦染色體正常，既往無自身免疫性疾病。

1.2 材料和方法

1.2.1絨毛組織 無菌采集研究對象絨毛組織，約1 cm×1 cm×1 cm，生理鹽水漂洗，置于凍存管內封存后-70℃儲存待檢，以提取組織總RNA。其余的絨毛組織用10%緩沖福爾馬林固定，石蠟包埋，切片。

1.2.2引物序列 IGF-Ⅱ上游引物：5’- ACTCGGCCAGAGCGGCG-3’，下游引物：5’- GCACCAGCATCGACTTCCCCA- 3’；MMP-9上游引物：5’- GGTGGACCGGATGTTCCCCG-3’，下游引物：5’- CGCGCCAGTAGAAGCGGTCC-3’； GAPDH上游引物：5’-A CCACAGTCCATGCCATCAC-3’，下游引物：5’-TCCACCACCTGTTGCTGTA-3’(上海生工生物工程有限公司)。

1.2.3主要試劑及儀器 Trizol Reagent(Invitrogen公司)。Reverse Transcription System(TAKARA公司)。SYBR? Premix Ex TaqTM (Perfect Real Time) (TAKARA公司)。兔抗人IGF-Ⅱ單克隆抗體、羊抗人MMP-9多克隆抗體、SP-9001免疫組化染色試劑盒、SP-9003免疫組化染色試劑盒及DAB顯色試劑盒均購自武漢博士德生物工程有限公司。CFX 96型熒光定量PCR儀(Bio-Rad)，Nanodrop 2000型核酸分析儀(Thermo)，ABI 9700型PCR儀(ABI)。

1.2.4實驗方法 (1)免疫組織化學染色：采用鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結(SP)法，實驗步驟嚴格按照說明書進行。(2)實時熒光定量PCR：取50～100 mg組織放于液氮預冷的研缽中，加入液氮研磨成粉末。移入盛有1 ml Trizol 的1.5 ml無RNA酶EP管，嚴格按照說明書步驟提取總RNA。用核酸分析儀測定RNA樣品濃度,測得OD 260/OD 280在1.8～2.0之間。1.5% agarose gel 2～4 μl RNA上樣，電泳檢測RNA完整性。按照逆轉錄試劑盒說明書步驟合成cDNA。PCR反應混合液總體積50 μl，包括subgreen mix (2×) 25μl、primer F(10 μM) 2 μl、primer R (10 μM) 2 μl、RT反應液(cDNA溶液)4 μl、dH2O(滅菌蒸餾水)17 μl冰上操作。設定以下PCR程序：95℃ 30秒，95℃ 5秒，60℃ 30～34秒共40個循環。繪制溶解曲線，計算△Ct值，進而計算2-△Ct。

1.2.5免疫組織化學染色結果判定 PBS代替一抗作為陰性對照。棕色或棕黃色顆粒沉著為陽性信號。在高倍鏡下，每張切片隨機選取5個視野，測定陽性信號的平均光密度。

2 結 果

2.1 實時熒光定量PCR檢測結果

正常早孕組絨毛樣品中可觀察到IGF-Ⅱ和MMP-9的熒光定量PCR擴增曲線(圖1)，說明IGF-Ⅱ及MMP-9基因在正常早期妊娠絨毛組織中均有表達。在早期自然流產組絨毛樣品中也可觀察到IGF-Ⅱ和MMP-9的熒光定量PCR擴增曲線(圖2)，說明IGF-Ⅱ及MMP-9基因在早期自然流產組絨毛組織中均有表達，但與對照組相比，二者擴增量均減少，說明早期自然流產組IGF-Ⅱ及MMP-9基因表達減少。根據相對定量公式計算早期自然流產組患者絨毛組織中及正常早期妊娠組絨毛組織中IGF-Ⅱ mRNA、 MMP-9 mRNA的相對表達量，顯示早期自然流產組絨毛組織的表達水平明顯低于正常早期妊娠組(表1)，差異有統計學意義(P<0.05)。

圖1 對照組IGF-Ⅱ和MMP-9的PCR擴增曲線

圖2 實驗組IGF-Ⅱ和MMP-9的PCR擴增曲線

組別nIGF-ⅡmRNAMMP-9 mRNA 正常早孕組 202.106±0.2460.281±0.052自然流產組300.632±0.2460.152±0.039t值20.24535.605P值0.00010.005

2.2 免疫組織化學染色結果

IGF-Ⅱ在正常早期妊娠絨毛組織的絨毛間質、絨毛小葉合體滋養細胞及細胞滋養細胞胞漿內彌漫性分布(圖3)。早期自然流產組絨毛組織中IGF-Ⅱ陽性細胞數量較正常早期妊娠組減少，染色稍減弱(圖4)。MMP-9在絨毛組織中的表達:MMP-9在正常早期妊娠組絨毛組織的絨毛小葉合體滋養細胞及細胞滋養細胞胞漿表達，間質中弱表達 (圖5)。早期自然流產組絨毛組織中MMP-9陽性細胞數量較正常早期妊娠組減少，呈淡棕黃色(圖6)。各組絨毛組織中IGF-Ⅱ的表達量:通過比較各組絨毛組織中IGF-Ⅱ的平均光密度值顯示，早期自然流產組IGF-Ⅱ的平均光密度明顯低于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。各組絨毛組織中MMP-9的表達量:通過比較各組絨毛組織中MMP-9的平均光密度值(MOD)顯示，早期自然流產組MMP-9的MOD明顯低于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。早期自然流產組患者絨毛組織中IGF-Ⅱ與MMP-9的直線相關分析:早期自然流產組絨毛組織中IGF-Ⅱ表達水平與相應部位的MMP-9表達水平呈正相關(r=0.491，P<0.05)。見圖7。

圖3 正常絨毛IGF-Ⅱ表達(×200)

圖4 自然流產絨毛IGF-Ⅱ表達(×200)

圖5 正常絨毛MMP-9表達(×200)

圖6 自然流產絨毛MMP-9表達(×200)

圖7 早期自然流產患者胎盤IGF-Ⅱ與MMP-9表達的關系

組別nIGF-Ⅱ平均光密度MMP-9平均光密度正常早孕組200.539±0.0200.464±0.061自然流產組300.271±0.0320.237±0.085t值33.30510.292P值0.00050.0001

3 討 論

妊娠是成功的半同種異體移植現象, 母-胎免疫耐受的建立是保證胚胎不被母體免疫系統排斥的關鍵。 這種免疫耐受既發生在母-胎界面局部，也發生在母體外周。母-胎界面是一個非常復雜的免疫微環境，涉及多個免疫系統及調節因子，調節機制非常復雜、精細。

胚胎植入過程類似于腫瘤細胞浸潤[4]，最基本的生物學過程是絨毛外細胞滋養層細胞向子宮內膜的遷徙、侵入。但與腫瘤細胞侵襲轉移本質不同，滋養層細胞的侵襲過程受母體及胚胎產生的多種細胞因子調控，這種嚴格調控使滋養層細胞僅侵入子宮內膜及肌層內1/3，且在妊娠中期停止。滋養層細胞先通過其膜表面受體與其周圍的ECM成分發生黏附，然后通過蛋白水解酶降解細胞外基質，同時滋養層細胞自身亦產生多種細胞外基質，形成新的外環境，以利于細胞遷移。這一過程中，蛋白水解酶起到重要作用。MMPs是細胞外基質降解過程中最重要的一類蛋白水解酶，在胚胎植入過程中起關鍵作用。

MMP-9屬于基質金屬蛋白酶系統中的明膠酶類，是滋養細胞侵入過程中的關鍵酶,它主要降解Ⅳ膠原及其他ECM,如膠原Ⅰ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅸ, 層黏連蛋白,纖維連接蛋白及玻連蛋白[5]。MMPs可能通過下列機制促進絨毛滋養細胞侵襲:①MMPs可直接發揮水解酶解的功能促進滋養細胞侵襲，作用于基底膜、蛻膜間質及血管腔面附著物，從而為滋養細胞侵襲清除了物理障礙。②可能與蛻膜細胞的凋亡有關。研究證明羊發育中的胎盤細胞凋亡與MMP、TIMP的關系為:凋亡大多發生在胎盤母胎界面頂端的細胞，這提示細跑外起支持作用的基質的降解可能啟動蛻膜細胞的凋亡，有助于絨毛分支的形成[6]。③MMPs除了直接作用于細胞外基質的主要成份外，還可以作用于其他蛋白而發揮其潛在的生物學作用，如MMP-1、MMP-2、MMP-3可降解胰島素樣生長因子結合蛋白(IGFBP-3、IGFBP-5)，而間接使游離IGF水平增加[7]。

滋養細胞的侵入受到高度精確的調控，主要表現在時間上限制在妊娠早期，空間上限制在內1/3子宮淺肌層。這種高度精確的調控機制依賴于促浸潤與抑浸潤因素兩者的共同作用，二者之間的動態平衡既滿足妊娠的生理要求又未超出正常限度。如果這種平衡被破壞，將導致病理妊娠的發生，如滋養細胞浸潤不足會導致自然流產、先兆子癇、胎兒生長受限等病理妊娠；如浸潤過度則導致滋養細胞腫瘤。多項研究表明自然流產絨毛滋養細胞MMP-9、MMP-2呈低表達[8-9]。

本研究采用免疫組化及實時熒光定量PCR技術檢測妊娠7～10周自然流產患者絨毛組織中的MMP-9 mRNA及蛋白表達，與對照組比較表達明顯降低，與以往報道結果相符，提示MMP-9表達降低，導致滋養細胞降解細胞外基質能力下降，浸潤能力減弱，絨毛侵入不足，最終導致流產。

IGF-Ⅱ又稱生長調節素A，含67個氨基酸殘基，分子量約為6.7 kDa，屬小分子多肽。人早孕絨毛滋養層細胞中IGF-ⅡmRNA陽性表達率為100%，在羊膜絨毛層內、絨毛小葉的合體滋養細胞、細胞滋養細胞中均有IGF-II表達[10]。

IGFs 是體內重要的生長因子，通過自分泌、旁分泌等方式對組織細胞的增殖、分化、凋亡、機體的生長發育及腫瘤的發生發展起重要的調節作用。孕卵的著床是一個非常復雜而調節精細的生理過程，有許多生長因子及其受體參與，而且這些生長因子對胚胎的發育、囊胚生成的比例、囊胚細胞數、新陳代謝和凋亡都有影響，IGFs是其中之一。胚胎著床的各個環節中都有IGFs的參與調節，體外培養證實添加IGF-Ⅱ對小鼠胚胎發育具有一定的促進作用[11]。

孕卵著床的過程中許多生長因子可上調滋養細胞MMPs的合成與分泌，其中最重要的一種即為IGFs。Irwind等[12]發現IGFs可以促進滋養細胞分泌MMP，進而加強滋養細胞的侵襲功能。在細胞滋養層的滋養細胞上IGF-Ⅱ mRNA呈梯度樣表達，在侵入的前緣部分IGF-Ⅱ mRNA表達最高，提示其在接觸中起作用。本研究免疫組織結果顯示IGF-Ⅱ在正常早期妊娠組絨毛組織中的合體滋養細胞及細胞滋養細胞均有表達，且均比自然流產組表達增加，說明其對絨毛的侵入具有促進作用,與以往研究相符。

研究表明自然流產患者IGF-Ⅱ呈低水平表達，本研究采用免疫組化及實時熒光定量PCR技術檢測早期自然流產患者絨毛組織中的IGF-Ⅱ，與對照組比較，呈低水平表達，與以往研究相符。

MMPs是滋養細胞分泌的唯一有效水解酶[13]，如分泌減少將影響其對細胞外基質的降解，進而影響滋養細胞對子宮肌層的浸潤和血管重鑄。本實驗表明，早期自然流產組絨毛組織中MMP-9表達明顯低于對照組，說明MMP-9減少可能影響絨毛滋養細胞侵入能力，導致自然流產；同時早期自然流產組中IGF-Ⅱ表達明顯低于對照組，且二者在絨毛組織中相應部位的mRNA及蛋白質表達均呈正相關，提示二者可能共同參與了自然流產的病理過程，絨毛中IGF-Ⅱ及MMP-9含量下降可能導致滋養細胞降解細胞外基質能力下降，侵入子宮螺旋小動脈能力不足，造成胎盤淺著床，從而導致自然流產。

總之，我們的實驗結果顯示，與正常早期妊娠相比，早期自然流產組絨毛組織中IGF-Ⅱ及MMP-9均呈低表達，且二者mRNA、蛋白質水平均呈正相關。提示IGF-Ⅱ及MMP-9可能共同參與了自然流產的病理過程，是導致自然流產的原因之一,但二者的具體作用機制尚待進一步研究證實。

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