單核細胞趨化蛋白-1啟動基因多態性與狼瘡腎炎相關性的研究*

武樹朋 李 芳 王 靜 張源潮

(1泰山醫學院附屬泰山醫院風濕免疫科,山東 泰安 271000； 2.山東大學附屬省立醫院,山東 濟南 250012 )

系統性紅斑狼瘡(SLE)是以引起抗體過度產生、補體異常活化、免疫復合物病理沉積、免疫功能持續紊亂為特征的多系統、多器官損害的自身免疫性疾病。單核細胞趨化蛋白-1(monocyte chemoattractant protein 1，MCP-1)是β類趨化因子，其功能為趨化白細胞及其它介質進入炎癥部位[1]。位于MCP-1-2518部位的基因多態性影響轉錄的活性[2]。在狼瘡腎炎(LN)活動期患者，位于腎小球和腎小管處MCP-1的表達數量是增加的，而其尿液MCP-1的水平也增加[3]。在本研究中，對于MCP-1 -2518位點基因多態性與SLE患者發生狼瘡腎炎危險性進行了檢測。

1 材料和方法

1.1研究對象 收集2005年6月～2006年2月在山東省立醫院風濕免疫科門診就診或住院SLE患者72例，所有患者均符合美國風濕病學會1997年修訂的SLE分類標準[4]。在確診為SLE的基礎上如有持續性蛋白尿>0.5 g/d或多次尿蛋白≥3+，或(和)細胞管型尿(可為紅細胞、血紅蛋白、顆粒或混合管型)，則可診斷為狼瘡腎炎[5]。根據SLE疾病活動指數(systemic lupus erythematosus disease activity index, SLEDAI)來評價患者的病情活動性[6]。健康對照組為來自山東省立醫院健康查體中心健康體檢者59例。

1.2研究方法

1.2.1外周血基因組DNA提取 從經過EDTA處理全血中獲得的外周白細胞抽提基因組DNA,該過程按照外周血基因組DNA抽提試劑盒操作說明進行。DNA抽提試劑盒購自上海申能博彩生物科技有限公司。

1.2.2聚合酶鏈反應(PCR) 查閱相關文獻及與GeneBank核對序列，設計合成MCP-1啟動基因PCR反應引物[7]，由上海生工生物工程技術服務公司合成。序列如下： 正向引物 5’-CCGAGATGTTCCCAGCACAGC-3’，反向引物 5’-CTGCTTTGCTTGTGCCTCTT-3’ 。PCR反應條件：94℃預變性3 min，然后94℃1 min、55℃1 min、72℃1.5 min循環35次，隨后在72℃延伸10 min。PCR反應試劑購自寶生物工程公司。

1.2.3限制性片段長度多態性分析(RFLP) 擴增產物經PvuII限制性內切酶(晶美生物工程公司)在37℃消化16 h。酶切產物進行2%瓊脂糖凝膠電泳，經凝膠顯像系統顯像并分析結果。

1.2.4基因型的判定 含有單一930 bp片段的樣本基因型為A/A，含有930、708、222 bp三種片段的樣本基因型為A/G，含有708、222 bp兩種片段的樣本基因型為G/G。

1.2.5統計學處理 應用SPSS13.0統計軟件進行統計分析。計量資料用均數±標準差表示。組間比較采用t檢驗。計數資料用相對數表示，組間比較采用χ2檢驗。以P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1實驗組與對照組的均衡性檢驗(表1) 納入本研究的SLE患者組72例，其中女性65例，男性7例，年齡(33.50±12.39)歲；對照組59例，其中女性53例，男性6例，年齡(33.20±11.68)歲。兩組性別構成、年齡構成經χ2檢驗無顯著性差異(P=0.932、P=0.840)，兩組平均年齡經t檢驗顯示無顯著性差異(P=0.889)，表明本研究SLE患者組及對照組在性別及年齡上具有可比性。

2.2MCP-1 -2518位點基因突變PCR-RFLP電泳結果(圖1) 野生型(A/A)不被限制性內切酶PvuII所酶切，顯示為930bp一條帶；同源突變型(G/G)被PvuII酶切為708、222bp兩片段，顯示為兩條帶；雜合突變型(A/G)被PvuII酶切為930、708、222bp三片段，顯示為三條帶。

表1 兩組研究對象的臨床資料分析

圖1 MCP-1-2518酶切產物瓊脂糖凝膠電泳圖

2.3MCP-1-2518位點基因型在SLE患者組及對照組中的分布(表2) 對照組A/A型基因型頻率顯著高于SLE患者組(P=0.001)。A/G型(P=0.024) 和G/G型(P=0.020)多見于SLE患者。

2.4MCP-1-2518位點基因型在狼瘡腎炎及無狼瘡腎炎SLE患者中的分布(表3) 與無狼瘡腎炎SLE患者相比，患狼瘡腎炎的SLE患者較常見基因型為A/G(P=0.024) 和G/G(P=0.015)。

表2 MCP-1-2518位點基因型在兩組中的分布

表3 MCP-1-2518位點基因型在SLE患者中的分布

3 討 論

SLE是由于遺傳、激素、環境等多因素相互作用引起機體免疫調節紊亂所致的一種自身免疫性疾病。自Biett 1882年最早描述SLE至今，其病因及發病機制尚未完全清楚。近年來,自從趨化因子受體被發現作為HIV感染的協同受體后[8],趨化因子研究領域引起廣泛的關注。而有研究[9]表明,HIV感染與SLE的免疫學以及臨床上有很大的相似。這就很自然的使人聯想到,與HIV感染有關的化學趨化因子可能與SLE發病或臨床有關。

MCP-1 是由內皮細胞(endothelial cell, EC) 、血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cells,VSMCS)和單核細胞(monocytes,MCS) / 巨噬細胞分泌的一種趨化因子,屬于趨化因子超家族。多種類型細胞包括血管內皮細胞、腎小球系膜細胞和巨噬細胞均可接受炎癥細胞因子例如IL-1 、TNF-α和IFN-γ和免疫復合物的刺激而表達MCP-1[10]。MCP-1 不僅是一種單核細胞趨化因子,在單核細胞上有MCP-1 的高度特異性受體[11],而且可以趨化T 淋巴細胞,MCP-1 趨化的T淋巴細胞表現型為記憶型, 產生應答的細胞目前發現:CD45RA-,CD45RO+,CD8+[12],MCP-1 能呈劑量依賴性誘導人外周血MC 表達組織因子[13]。MCP-1 能誘導血管平滑肌細胞、內皮細胞表達粘附分子,粘附分子可促進單核細胞對內皮細胞的粘附并向內皮下遷移。MCP-1 能誘導白介素的表達[14]。MCP-1 還能誘導單核細胞鈣離子內流,引起呼吸爆發、氧自由基的大量釋放,導致血管內皮細胞損傷。細胞內外鈣離子濃度也能影響單核細胞向內皮下遷移。因此,MCP-1 對單核細胞內皮下的募集起到啟動和放大作用。

MCP-1多態性在SLE的作用已經有許多研究者予以檢測，但卻得出不同的結論。本研究顯示MCP-1-2518位點基因型為A/G或G/G型的SLE患者有患狼瘡腎炎的3～6倍高危險性，而基因型為A/A 型的SLE患者則具有較低的患狼瘡腎炎的危險性。該研究得出的結論與美國研究人員Marco Tucci等[7]報道一致。然而，西班牙研究人員對SLE病人的檢測，A/G基因型與血管炎的發生有關，但與狼瘡腎炎的發生發展無關聯性[15]，很可能是該研究中研究樣本的民族組成與我們研究的不同導致的。韓國人Kim HL等[16]的研究發現A/A基因型的SLE病人具有較高的尿MCP-1水平，而且該基因型的狼瘡腎炎病人具有較差的預后，而所有其他研究人員對于MCP-1 -2518位點基因多態性的檢測顯示A/G或G/G基因型的被研究者具有較高的血或尿MCP-1水平，只能推測在韓國人群中還有其他的基因突變影響MCP-1。Tucci M等[17]的研究發現，臺灣地區兒童群體系統性紅斑狼瘡的發生發展與 MCP-1-2518基因突變不存在相關性，而與同為CC類趨化因子的RANTES(reduced upon activation,normal T expressed secreted;正常T細胞表達、分泌、活化時表達下降的因子)存在相關性。為進一步確證MCP-1-2518位點基因多態性在SLE 發病中的作用還應擴大樣本量,從不同的實驗角度論證。

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