高效液相色譜法測定葉酸水解制備蝶酸的含量*

張 許 劉 衛(wèi)

(1.泰山醫(yī)學院，山東 泰安 271016； 2.中國人民解放軍第八十八醫(yī)院，山東 泰安 271000)

蝶酸是葉酸結構的一部分。曹曦元等[1]曾報道蝶酸能拮抗蓖麻毒素(Ricin)A鏈蛋白，常作為陽性對照藥研究化合物拮抗蓖麻毒素A鏈蛋白的作用。蓖麻毒素A鏈蛋白具有很強的抑制蛋白質合成的功能，是一種生化武器，目前臨床沒有有效的解毒劑，而其原料獲得和提取、純化工藝都不復雜[2-3]。所以，研究蓖麻毒素解毒劑具有重要的現(xiàn)實意義。本研究利用葉酸水解實驗制備得到蝶酸粗品，初步精制后建立其含量測定方法，為今后的實驗提供原料。

1 材料與方法

1.1儀器與試劑 Lablliance高效液相色譜儀，Scientific System,Inc；配有二級陣列管UV6000LP型紫外檢測器，Scientific System,Inc；BT124S型電子天平，北京多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；甲醇為色譜純；鹽酸、冰醋酸、三乙胺、氨水均為分析純；蝶酸對照品(≥93%)，購自Sigma公司；蝶酸供試品為本實驗室用葉酸水解制得。

1.2葉酸水解試驗

1.2.1試驗原理 酰胺水解有兩種方法，一是酸堿催化，在pH=3或者pH﹥13的條件下可以水解。二是用酰胺水解酶。本實驗采用酸性條件下水解。

1.2.2試驗步驟 葉酸45 g加蒸餾水300 ml，加HCl溶解成褐色澄清溶液，控制pH值3左右，攪拌加熱至80～90℃，水解2.5 h。冷卻至室溫，抽濾得產物晾干，稱重。將第一步水解產物溶于氨水，加少量活性炭煮沸10 min脫色，抽濾，濾液加HCl調pH值至弱酸性，冷卻至室溫。抽濾得產物，晾干。

1.3色譜條件 色譜柱：PhenomexneC18(250 mm×4.6 mm)，流動相甲醇︰水(含2%醋酸、0.2%三乙胺)為25︰75，流速1 ml/min。樣品溶劑為0.375%氨水。波長：285 nm。

1.4對照品及樣品制備 準確稱取10 mg蝶酸對照品，用0.375%氨水溶解于50 ml容量瓶并定容至刻度，搖勻得0.2 mg/ml對照品。臨用前稀釋至所需濃度，進樣20 μl，以保留時間定性，峰面積定量。準確稱取樣品50 mg。用0.375%氨水溶解于50 ml容量瓶并定容至刻度，搖勻得1 mg/ml。臨用前稀釋至所需濃度，進樣20 μl，以保留時間定性，峰面積定量。

1.5計算方法 采用外標法測定蝶酸含量，根據(jù)公式：m待測物=A待測物×m標準物/A標準物。所以其含量為：m待測物/m樣品進樣量×100%。A為峰面積，m為藥物質量。

2 結果與計算

2.1色譜分離 二極管陣列檢測器檢測譜圖顯示在285 nm處有最大吸收，選用本色譜條件，分析效果和保留時間都比較理想(圖1～3)。

圖1 二極管陣列全波長掃描圖

圖2 蝶酸粗品

圖3 蝶酸標準品

2.2線性試驗 精密量取對照品0.4，0.8，1.2，1.6，2.0，2.4 ml, 置50 ml量瓶中，用0.375%氨水溶解并定容, 搖勻，得1.6，3.2，4.8，6.4，8，9.6 μg/ml溶液。在上述色譜條件下分別進樣測定, 記錄色譜圖。以進樣量(μg)為橫坐標,峰面積A為縱坐標繪制標準曲線,得回歸方程,結果見圖4。

圖4 蝶酸線性方程標準曲線

回歸方程為:y=463589x + 52911，相關系數(shù)為r=0.9991，表明蝶酸在1.6～9.6 μg濃度范圍內呈良好線性關系。

2.3精密度試驗 吸取對照品溶液8 μg/ml和4 μg/ml按上述色譜條件連續(xù)進樣6次，每次20 μl，結果見表1，RSD分別為1.15%和1.73%。

表1 精密度實驗結果

2.4穩(wěn)定性試驗 取供試品配制成濃度為20 μg/ml的溶液按上述色譜條件分別在0，2，4，6，8，10，12小時進樣，結果見表2，RSD= 0.42%，結果表明蝶酸在12小時內基本穩(wěn)定。

表2 穩(wěn)定性試驗結果

2.5含量測定 取8 μg/ml和4 μg/ml的蝶酸標準液，各自峰面積平均值為A1標準物和A2標準物，20 μg/ml的樣品穩(wěn)定性試驗平均值為A待測物，根據(jù)公式測得蝶酸含量為72.5%和73.5%。取平均值73%。

2.6加樣回收率試驗 稱取粗品6份，分別加入3 mg蝶酸標準品，按樣品溶液制備方法操作得加樣回收溶液，按上述色譜條件操作進樣，結果見表3，平均回收率為98.9%，結果表明本方法回收率較高。

表3 加樣回收試驗結果

3 討 論

蝶酸由于其溶解性不好，限制了其開發(fā)利用[4]，所以現(xiàn)在多用于做對照品，目前也沒有報道改變其溶解度的研究，可能因為蝶酸在市面上難以購買。本實驗用葉酸水解制備蝶酸得到的粗品，操作步驟簡單，試劑成本低，適用于實驗室小量合成，雖然純度不高，根據(jù)需要再進一步純化基本能滿足下一步實驗的要求。含量測定方法參考葉酸的標準，但大部分葉酸的測定標準都采用磷酸鹽為流動相，其配置和沖洗色譜柱的過程繁瑣，且對色譜柱的損害也比不含鹽的流動相損害嚴重，本實驗采用的流動相簡單易配置，省時省力又延長了色譜柱的使用壽命。經過多次實驗證實靈敏度高，選擇性好，無干擾，結果令人滿意。

[1] 曹曦元，趙青，黎燕，等. 蝶酸對天然蓖麻毒素及重組蓖麻毒素A鏈蛋白的拮抗作用研究[J].軍事醫(yī)學科學院院刊，2010，34(1)：12-15.

[2] 鄭成，雷德柱，雷雨，等. 蓖麻毒蛋白提取[J].廣東化工，2003(5):1-4.

[3] 余濤，唐吉軍，郝蘭群，等. 一種純化蓖麻毒素的新方法[J].生物技術，2005，15(5)：53-55.

[4] Yan X, Hollis T, Svinth M, et al. Structure-based identification of a ricin inhibitor[J]. J Mol Biol, 1997, 266(5):1043-1049.