益生菌Gan－1的鑒定、理化特性及其降膽固醇作用

劉秋，鐘世期，劉長健，閆建芳，于基成

（大連民族學院生命科學學院，遼寧大連 116605）

益生菌Gan－1的鑒定、理化特性及其降膽固醇作用

劉秋，鐘世期，劉長健，閆建芳，于基成

（大連民族學院生命科學學院，遼寧大連 116605）

從啤酒樣品中分離出一株具有較強的耐酸、耐鹽、耐膽鹽及降膽固醇能力的細菌菌株Gan－1。利用多相分類方法，即通過形態特征、生理生化特性以及16S rRNA核酸序列分析，鑒定出菌株Gan－1為干酪乳桿菌（Lactobacillus casei Gan－1）;采用MRS－Broth培養基，模擬人體胃酸環境、滲透壓環境和膽鹽環境，測定在酸性及高膽鹽環境作用下菌株Gan－1的生長狀況。結果表明，菌株能夠耐受pH3的環境、低于6%NaCl的高滲環境以及低于2.0%的膽鹽環境;菌株具有降解膽固醇的能力，培養至24 h時，降解的膽固醇達24%。

干酪乳桿菌;耐酸;耐膽鹽;降膽固醇

干酪乳桿菌（L.casei）是一種益生菌，能夠耐受口腔中的酶、胃液中的低pH值酸和小腸的膽汁酸等，可以在腸道內大量存活，并能起到調節腸內菌群平衡、促進人體消化吸收等作用。此外，干酪乳桿菌具有降低膽固醇、誘導其自身產生抗菌素、促進細胞分裂和產生抗體免疫及抗癌等特性。

1 材料與方法

1.1 儀器

TC－512 Thermal Cycler PCR儀（Techne，英國）;凝膠成像系統（UVP，美國）;J2－MC型高速冷卻離心機（Beckman，美國）。

1.2 培養基

NBB培養基（購買于德國柏林）;PYG培養基:參照文獻［1］;改良MRS培養基（100 mL）:胰蛋白胨1 g、牛肉浸膏0.8 g、酵母浸膏0.4 g、麥芽糖3.5 g、醋酸鈉0.5 g、吐溫80 0.1 mL、檸檬酸三銨0.2 g、磷酸氫二鉀0.2 g、硫酸鎂0.02 g、硫酸錳0.005 g、pH5.7±0.2;高膽固醇培養液MRSO－CHOL:參照文獻［1］。

1.3 菌株的分離及篩選

自啤酒發酵液中通過濾膜過濾（0.02 μm），采用NBB培養基厭氧分離培養7 d，分離獲得編號為Gan－1的菌株，經純化后保存至含0.3%牛膽鹽的MRS培養基中備用。

1.4 菌株的鑒定

1.4.1 形態特征觀察

將菌株Gan－1在35℃恒溫下培養24 h，進行形態特征觀察。

1.4.2 菌株Gan－1的DNA提取及16S rDNA序列分析

菌體Gan－1 DNA的提取方法見參考文獻［2］，菌株基因組的擴增、產物回收、重組連接、轉化及陽性克隆篩選均參照文獻［3］，引物為F27:5＇＞AGAGTTTGATCCTGGCTCAG＜3＇;R1492:5＇＞TACCTTGTTACGACTT＜3＇。測序委托上海生工生物工程技術服務有限公司完成。所得16S rDNA序列在Genbank數據庫中與已知細菌16S rDNA序列進行同源性比對，利用MEGA4軟件構建系統進化樹，并將菌株16S rDNA序列提交Genbank進行注冊。

1.4.3 菌株Gan－1的生化特性

辣椒不同種質資源種子萌發期耐鹽性評價………………………………………… 高晶霞，顏秀娟，吳雪梅，謝 華，王學梅（102）

對菌株Gan－1分別進行糖發酵產酸試驗、過氧化氫酶試驗、硝酸鹽還原試驗、精氨酸水解試驗、明膠液化試驗、淀粉水解、硝酸鹽水解等生理生化測定［4］。

1.5 菌株Gan－1的耐酸試驗

配制菌株Gan－1的菌懸液（106 cfu·mL－1，以下同），按2%（體積比）的接種量接種至不同pH的MRS－Broth培養基中，35℃靜置培養12 h，于600 nm下測定OD值。

1.6 菌株Gan－1的耐鹽試驗

按2%（體積比）的接種量接種至含不同濃度氯化鈉的MRS－Broth培養基中，35℃靜置培養12 h，于600 nm下測定OD值，測定菌株的耐滲透壓性。

1.7 菌株Gan－1的耐膽鹽試驗

按2%（體積比）的接種量接種至添加不同濃度的牛膽鹽MRS－Broth培養基中，35℃靜置培養12 h，于600 nm下測定OD值。

1.8 菌株Gan－1的降膽固醇試驗

按1%（體積比）的接種量接種至MRS－膽鹽－膽固醇培養基中，厭氧35℃培養20 h，然后離心除去菌體。上清液中的膽固醇含量采用鄰苯二甲醛法測定［6］。培養基中原有的膽固醇量與上清液中膽固醇量的差值為膽固醇的沉淀量。

2 結果與討論

2.1 菌株Gan－1的鑒定

2.1.1 形態學鑒定

將分離純化菌種在35℃恒溫下培養24 h，菌株gan－1的菌落形態為圓形，直徑1.0～3.5 mm，隆起，濕潤，乳白色，不透明;菌體形態為圓端分節的桿狀，多數為C型2～9節，少數10節以上，寬0.1～1.5 μm，長4.1～6.4 μm，集聚成團或平行疊加（如圖1）;革蘭氏染色陽性，無芽孢，兼性厭氧。

圖1 菌株Gan－1的形態（×40）

2.1.2菌株Gan－1的生化特性

將菌株Gan－1與乳酸桿菌屬的模式菌株進行生理生化特性比較，由測定結果可知，菌株Gan－1的H2O2酶試驗、V－P試驗、吲哚試驗、明膠水解、淀粉水解、精氨酸水解、硝酸鹽利用、H2S試驗均為陰性，與干酪乳桿菌（L.casei）的生理生化特性基本一致。但是，從糖利用試驗結果可知，菌株Gan－1可利用麥芽糖和蔗糖作為碳源，這與干酪乳桿菌（L.casei）模式菌株有所差異。

2.1.3 菌株Gan－1的16S rDNA序列分析

菌株Gan－1的16S rDNA PCR基因擴增結果如圖2，擴增出1 600 bp左右的目的基因片段;利用BLAST搜索軟件將菌株Gan－1的16S rDNA序列測序結果與GenBank數據庫中相關菌株的16S rDNA序列進行比對，比對結果表明，菌株Gan－1與Lactococcus lactis，L.casei以及L.paracasei subsp paracasei同源性均達到99%。

圖216 S rDNA PCR擴增產物的瓊脂糖凝膠電泳

2.2 菌株Gan－1的耐酸試驗

人體消化道正常pH值范圍為2～8，胃液pH值隨飲食結構的變化波動很大，通常pH值為3.0。本文選擇4個不同pH值進行測試。人體消化過程約需4 h，而食品通過胃的時間相對較短，一般為1～2 h，因此設定培養時間為4 h。菌種活化至活菌數約2×108cfu·mL－1，而活菌發揮功能特性的菌數臨界值為106cfu·mL－1，因此將經酸作用后活菌對數下降小于2作為耐酸性標準［7］。試驗結果如圖3。菌株Gan－1在pH值為3.0條件下，2 h后活菌數由108cfu·mL－1降至107cfu· mL－1，4 h后活菌數仍在106cfu·mL－1以上;在pH值為2條件下，2 h后活菌數降至105cfu· mL－1，4 h后活菌數降至104cfu·mL－1。由此可以看出，菌株Gan－1耐受pH值為3的酸性環境。食物攝入2 h后通過胃到達腸道。該菌株耐受胃酸，可以通過胃進入腸道發揮作用。

圖3 耐酸試驗結果

2.3 菌株Gan－1的耐鹽試驗

菌株Gan－1在不同滲透壓下的耐受結果如圖4。由圖4可知，菌株Gan－1在含6.0%NaCL的培養基中仍能生長，說明其耐滲透壓的效果很好。

圖4 耐鹽試驗結果

2.4 菌株Gan－1的耐膽鹽試驗

人體不同部位的膽汁酸的濃度不同。膽汁酸鹽含量為0.3%～0.5%、膽鹽含量為0.3%是衡量菌株耐受人體腸道膽汁酸的標準。耐酸試驗（pH3）中，菌株Gan－1在2 h后通過胃到達腸道，活菌數降至3×107cfu·mL－1，因此耐膽鹽試驗接種量設定為3×107cfu·mL－1。食物通過腸道的時間約2～3 h，設定培養時間4 h。試驗結果如圖5。菌株Gan－1在0.3%膽鹽環境下活菌數有所下降，但3 h后活菌數仍在106cfu·mL－1以上，高于活菌發揮功能特性的菌數臨界值。菌株Gan－1對不同膽鹽的耐受性沒有顯著差異。由此表明，所篩選菌株具有一定的抗膽汁鹽能力，可順利通過小腸到達大腸。

圖5 耐膽鹽試驗結果

2.5 菌株Gan－1的降膽固醇試驗

在0.3%膽鹽含量下測定菌株Gan－1的降解膽固醇能力，試驗結果如圖6。在24 h內，菌株Gan－1生長狀態良好，膽固醇的降解率也逐步升高，至24 h時，降解的膽固醇達24%。

圖6 不同時間培養液中膽固醇降解率

3 結論

干酪乳桿菌（L.casei）相關菌株是經長期驗證對人體無毒副作用，且廣泛用于保健食品生產的益生菌。關于干酪乳桿菌的分類地位一直多有爭議，本文利用16S rDNA核酸序列比對分析中，菌株Gan－1與乳酸乳球菌（L.lactis）、副干酪乳桿菌亞種（L.paracasei subsp paracasei）、干酪乳桿菌（L.casei）親緣關系均較近，但乳酸乳球菌細胞呈球形或卵圓形，與菌株Gan－1的菌體形態差別較大。Dellagio等根據可溶性蛋白電泳圖譜分析和DNA－DNA同源性分析，取消了副干酪乳桿菌亞種（L.paracasei subsp paracasei）的名稱，將其合并為L.casei。本文將菌株Gan－1與L.casei的模式菌株的形態特征、生理生化特性進行了比較分析，二者在糖源利用上存在一定的差異，菌株Gan－1可利用麥芽糖和蔗糖作為碳源，因此將菌株Gan－1鑒定為L.casei的一個亞種。

活菌含量106cfu·mL－1是菌株發揮降膽固醇功能特性的菌數臨界值。胃酸和膽鹽具有抗菌作用，乳酸桿菌被食入后不僅要通過惡劣的胃液，還要抵抗來自胰腺的膽鹽。因此耐酸、耐膽鹽特性是乳酸桿菌作為功能性食補因子的重要指標之一，并由計算得出pH值為3、膽鹽為0.3%是衡量菌株耐受人體胃腸道的標準。本文模擬人體胃腸環境，以菌株的初始接種量為2×108cfu· mL－1，經耐酸、耐膽鹽連續試驗，活菌數仍在106cfu·mL－1以上，表明有足夠數量的菌株Gan－1通過胃腸道而保持活性，發揮降膽固醇的益生作用。

目前干酪乳桿菌（L.casei）多從乳制品中獲得，對開發功能性乳制品具有重要意義。而菌株Gan－1是從啤酒樣品中分離獲得，其不僅對營養的需求更為簡單，同時其較高的活性也使該菌株不僅應用領域更寬泛，并可用于食品的防腐保鮮。實驗結果表明，該菌株同樣具有耐酸、耐膽鹽和降解膽固醇的能力，可作為益生菌的備選菌株，但需要保證食品中一定的活菌數目。

［1］劉麗莉，董鐵有，楊協立.6種乳酸菌降解膽固醇的體外試驗［J］.河南科技大學學報，2005，12（6）:85－88.

［2］朱炳林，張茜茜，方維煥.瑞士乳酸桿菌HZ521株的分子鑒定及其部分生物學特性研究［J］.動物醫學進展，2009，30（2）:49－52.

［3］張剛.乳酸細菌基礎、技術和應用［M］.北京:化學工業出版社，2004.

［4］胡書芳，王雁萍，洪愛俊，等.自然發酵酸菜中乳酸菌的分離鑒定及其生理特性研究［J］.安徽農業科學，2009，37（15）:6896－6898.

［5］靳志強，王延祥，李平蘭，等.植物乳桿菌耐酸耐膽鹽的體外試驗及其降膽固醇作用［J］.中國食品學報，2009，10（5）:24－28.

［6］劇檸，王曉蘭，李澤，等.乳酸菌降膽固醇作用研究現狀［J］.微生物學通報，2009，36（1）:125－129.

Identification，Physico－chemical Characteristics of Strain Gan－1 and its Effect of Cholesterol Reducing in Vitro

LIU Qiu，ZHONG Shi－qi，LIUChang－jian，YAN Jian－fang，YU Ji－cheng
（College of Life Science，Dalian Nationalities University，Dalian Liaoning 116605，China）

A strain Gan－1 which has the strong resistant ability for acid，salt，and bile salt and the good cholesterol reducing was screened from beer samples.The morphological，physiological，biochemical characteristics and 16S rRNA gene sequence of the strain Gan－1 were analyzed.Then the strain Gan－1 was identified as Lactobacillus casei Gan－1 by polyphasic taxonomy method.By stimulating human gastric acid and intestinal bile salt condition，the viability of Gan－1 strain during exposure to acid MRS broth，high salt MRS broth and bile salt MRS broth were determined，respectively.Then the bile salt hydrolase activity of Gan－1 strain，degradation of bile salt and cholesterol precipitation were measured in this bile salt concentration.The results show that the strain Gan1 has tolerance capability to the pH=3，6%salt and 0.3%bile salt environment and can reduce cholesterol.In MRS medium with cholesterol，strain Gan－1 degrades 24%of cholesterol.

lactobacillus casei;acid resistant ability;bile salt resistant ability;cholesterol reduction

Q935

A

1009－315X（2012）03－0198－04

2011－12－06;最后

2011－12－20

國家自然科學基金項目（31070005）;中央高校基本科研業務費專項資金資助項目（DC10030102，DC10030102）。

劉秋（1969－），女，遼寧大連人，教授，博士，學校優秀學術帶頭人主要從事微生物學研究。

（責任編輯 鄒永紅）