氣導(dǎo)聽覺剝奪幼鼠螺旋神經(jīng)節(jié)NSE表達(dá)

王楓謝寧田建偉朱曉全武軍

(1.空軍總醫(yī)院，100142；2.空軍航空醫(yī)學(xué)研究所附屬醫(yī)院，100089；3.空軍工程大學(xué)機要系，100097)

研究發(fā)現(xiàn)，多種動物的感覺系統(tǒng)在發(fā)育的過程中都有一個關(guān)鍵時期，在這個時期內(nèi)，去除或者改變傳入神經(jīng)沖動對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和功能可以產(chǎn)生極大的影響[1-3]。聽覺剝奪效應(yīng)(auditory deprivation effect)是1996年由15位著名聽力學(xué)家組成的Eriksholm工作組討論提出，并定義為由于聲學(xué)信息的減少導(dǎo)致的聽覺功能的逐漸下降[4]。在現(xiàn)實生活中，越來越多的耳科醫(yī)生注意到聽覺剝奪對耳病患者的聽覺產(chǎn)生了不良影響，包括聽閾的提高和言語識別率的降低。大腦發(fā)生聽覺剝奪效應(yīng)后產(chǎn)生的解剖生理學(xué)改變，目前的研究都是通過動物實驗間接獲得。耳蝸切除是常用的聽覺剝奪動物模型的造模方法，因其破壞了耳蝸毛細(xì)胞的完整性，不能通過聽覺電生理的方法檢測動物的聽功能，同時使得對聽覺傳導(dǎo)通路的起始部位——螺旋器(Corti器)的研究無法進行。我們選擇幼年動物進行氣導(dǎo)聽覺剝奪，一方面減少發(fā)育關(guān)鍵期聽覺系統(tǒng)聲音信號的輸入，另一方面保持耳蝸的正常結(jié)構(gòu)，目的在于獲得聽覺剝奪對聽覺系統(tǒng)中螺旋神經(jīng)節(jié)發(fā)育的影響結(jié)果。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 實驗動物采用清潔級SD乳鼠60只，雌雄不限，由第四軍醫(yī)大學(xué)動物實驗中心提供。

1.1.2 試劑 兔抗神經(jīng)元特異性烯醇化酶 (neuronal specific enolase，NSE)多克隆抗體、SABC試劑盒購自武漢博士德公司。

1.1.3 儀器 聽覺電生理檢測儀(Biologic，Traveler Express E，USA)。冰凍切片機(德國LEICA CM1850)。

1.2 方法

1.2.1 動物分組 實驗動物隨機分為對照組和AD(Auditary Deprivation)組。AD組大鼠飼養(yǎng)于密閉隔音室，生后12 d起行耳道填塞至生后42 d；對照組大鼠正常食水、在正常聲音環(huán)境中飼養(yǎng)。

1.2.2 模型制備 采用文獻(xiàn)[5]方法進行耳道填塞(圖1)。

1.2.3 腦干誘發(fā)電位(ABR)檢測 采用聽覺電生理檢測儀(Biologic，Traveler Express E，USA)于出生后42 d分別對對照組、AD組大鼠進行ABR檢測。

將實驗動物以2％戊巴比妥鈉100 mg/kg行腹腔注射麻醉。記錄電極刺入矢狀縫與兩外耳道連線交點頭皮下，參考電極放置在刺激耳后皮下，接地電極放置在大鼠尾根部皮下。交替短聲刺激，聲源距外耳孔1.0 cm，刺激間隔為0.1 ms，濾波帶通為100～2 000 Hz，掃描時間為10 ms，疊加次數(shù)為512次。大鼠ABR共有5個波，其中以Ⅱ、Ⅲ波為主，以剛剛出現(xiàn)可以辨認(rèn)的Ⅱ或Ⅲ波為標(biāo)準(zhǔn)，記錄ABR聽閾值，并分別記錄潛伏期和交替短聲刺激后幅值。測試在雙層屏蔽室內(nèi)進行，環(huán)境噪聲≤40 dB SPL。測試時注意對動物保溫。

1.2.4 免疫組織化學(xué)染色

1.2.4.1 冰凍切片標(biāo)本制備 于出生后42 d分別進行AD組和對照組大鼠耳蝸冰凍切片。實驗動物如前法麻醉，4％多聚甲醛心內(nèi)灌流固定，斷頭，取聽泡置4％多聚甲醛后固定過夜。10％EDTA脫鈣，30％蔗糖脫水至沉底，OCT包埋，冰凍切片機連續(xù)切片，層厚10μm。

1.2.4.2 螺旋神經(jīng)節(jié)NSE染色及神經(jīng)元計數(shù) 一抗為兔抗NSE多克隆抗體，濃度為1∶300，二抗為生物素標(biāo)記的羊抗兔二抗。DAB顯色，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。光學(xué)顯微鏡下觀察，照相。陰性對照以PBS代替一抗。

每張切片選取耳蝸第二轉(zhuǎn)螺旋神經(jīng)節(jié)、隨機取60個高倍視野進行細(xì)胞計數(shù)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差 (x±s)表示，應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理，組間差異應(yīng)用t檢驗，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ABR閾值及潛伏期比較 氣導(dǎo)聽覺剝奪至出生后42 d，對照組及AD組大鼠的ABR閾值分別為 (26.67±3.89)dB SPL和(38.18±5.54)dB SPL，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析P＜0.01，差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義。對照組和AD組Ⅰ波到Ⅴ波各波潛伏期統(tǒng)計結(jié)果P＞0.05，差異無統(tǒng)計學(xué)意義；對照組和AD組Ⅰ波到Ⅴ波各波幅值統(tǒng)計結(jié)果Ⅱ波、Ⅲ波、Ⅴ波幅值P＜0.05，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(表1～2，圖2～3)。

2.2 兩組大鼠腦干傳導(dǎo)時間比較 ABR各波中Ⅴ波最為穩(wěn)定，且振幅最高。波Ⅰ～Ⅴ間期也稱為腦干傳導(dǎo)時間或中樞傳遞時間。AD組與對照組波Ⅰ～Ⅴ間期比較，對照組為(3.978±0.435)ms，AD組為(3.629±0.616)ms，P＜0.001，差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義。

2.3 螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元NSE染色神經(jīng)元形態(tài)及計數(shù)比較對照組大鼠螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元NSE染色顯示正常神經(jīng)元NSE主要存在于胞漿，胞體著色明顯，核著色略淺淡，胞體排列有一定密度，不能從形態(tài)上區(qū)分兩型神經(jīng)元。胞體發(fā)出的神經(jīng)纖維著色較胞體略淺。AD組大鼠免疫組化顯示神經(jīng)元顯色較對照組明顯變淺，形態(tài)模糊，排列紊亂，神經(jīng)纖維著色基本正常(圖4)。

神經(jīng)元計數(shù)結(jié)果對照組為(10.643±1.104)個/HP，AD組為(7.883±0.987)個/HP，兩組比較，P＜0.05，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

圖1 SD大鼠氣導(dǎo)聽覺剝奪方法

圖2 ABR各波潛伏期

圖3 ABR各波幅值

圖4 螺旋神經(jīng)節(jié)NSE免疫組織化學(xué)染色

表1 ABR各波潛伏期(m s)(n＝30，x±s)

表2 ABR各波幅值(μV)(n＝30，x±s)

3 討論

人們早已發(fā)現(xiàn)，改變嗅覺、視覺和聽覺系統(tǒng)中感覺輸入信號會影響相應(yīng)系統(tǒng)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)在形態(tài)和功能上的發(fā)育與成熟[1-3]。有研究證實聽覺剝奪可以延緩大鼠上外橄欖核(LSO)神經(jīng)元抑制性突觸的發(fā)育。Sanes等發(fā)現(xiàn)，破壞出生后1周大鼠的耳蝸將導(dǎo)致與抑制性突觸相關(guān)的、軸索和樹突正常的形態(tài)學(xué)再變構(gòu)過程的阻斷[6]。通過破壞幼年砂鼠單側(cè)耳蝸以阻斷聲輸入則可以阻斷LSO神經(jīng)元抑制性突觸和樹突的形態(tài)發(fā)育[7]。目前的研究觀察到聽覺剝奪導(dǎo)致耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞發(fā)生退行性變，這可能歸因于聲刺激的減少。在完全缺乏聲刺激(耳蝸毀損)較聽覺剝奪對螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的影響更為明顯[8]。大鼠生后發(fā)育“關(guān)鍵期”一般認(rèn)為從第12天開始，到第30天結(jié)束[9-10]，我們選擇在生后12～42 d對大鼠進行聽覺剝奪，目的在于減少發(fā)育關(guān)鍵期聽覺系統(tǒng)聲音信號的輸入，希望從相反方向證明正常的聲音刺激對螺旋神經(jīng)節(jié)發(fā)育的促進作用。

ABR檢測結(jié)果顯示，AD組與對照組比較，聽閾值升高約10 dB，ABR波幅降低，P＜0.05，差異有統(tǒng)計學(xué)意義；兩組大鼠ABR各波幅值比較，Ⅱ波、Ⅲ波、Ⅴ波幅值的差異有統(tǒng)計學(xué)意義，P＜0.05。ABR檢測中，Ⅰ波是辨認(rèn)其他各波的基準(zhǔn)，尤為重要。波Ⅴ常是最高的峰，改變給聲重復(fù)率和降低聲強，對波Ⅴ的出現(xiàn)率影響較少，在其他波消失后，波Ⅴ還繼續(xù)存在。而峰間期中尤以Ⅰ～Ⅴ間期最為重要。因此，我們在計算了各波的幅值和潛伏期后，對Ⅰ～Ⅴ間期也進行了統(tǒng)計學(xué)分析，AD組與對照組相比，P＜0.01，差異顯著。AD組較對照組Ⅱ波、Ⅲ波、Ⅴ波幅值降低，說明其各自來源部位耳蝸核、上橄欖核、下丘功能受到影響。以上結(jié)果可以證實，氣導(dǎo)聽覺剝奪對動物的聽覺功能造成了損害，進而可以推測其對聽覺傳導(dǎo)通路的相關(guān)部位產(chǎn)生了不良影響。

烯醇化酶是1934年Lohman和Mayerhof在研究肌肉提取物中磷酸甘油酸向丙酮酸轉(zhuǎn)化的過程中發(fā)現(xiàn)的。烯醇化酶是糖酵解途徑中的關(guān)鍵酶，普遍存在于生物體的糖酵解代謝中，它既可催化糖酵解過程中2-磷酸-D-甘油酸(PGA)向磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)的轉(zhuǎn)化，又可在糖原合成過程中催化逆向反應(yīng)，即作為磷酸丙酮酸水合酶，使PEP向PGA轉(zhuǎn)化，在細(xì)胞能量代謝中起重要作用[11]。在脊椎動物中，烯醇化酶存在3種同工酶：α、β、γ[12]。α、β、γ烯醇化酶分別由3種不同的基因所編碼，所有的烯醇化酶活性形式均為二聚體，即由兩個亞單位組成，目前已知有5種形式的組合：αα、ββ、γγ、αβ、αγ[13]。神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)主要分布于神經(jīng)元和神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞的胞漿中。周圍神經(jīng)中NSE含量遠(yuǎn)低于腦組織，相差10～100倍。在我們的觀察中，AD組螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元NSE染色著色變淺，ABR聽閾較對照組明顯提高，這可能是由于神經(jīng)傳入信號的減少誘導(dǎo)了NSE基因表達(dá)的下調(diào)，繼發(fā)細(xì)胞能量代謝障礙，影響神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)正常糖酵解過程，使三磷酸腺苷減少，干擾神經(jīng)元的正常功能所致。

聽覺的產(chǎn)生和傳導(dǎo)是一個復(fù)雜的過程，是聽覺感受器和聽覺傳導(dǎo)通路共同作用產(chǎn)生的結(jié)果，在這個復(fù)雜的過程中，很難說聽覺剝奪對聽覺系統(tǒng)發(fā)育關(guān)鍵期的哪個部位產(chǎn)生了影響，很有可能多個部位同時受累，具體的結(jié)果還有待于今后的深入研究。

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