大麥成熟胚培養高再生率品種的篩選

藍 慶 楊建明 華 為

(1.云南農業大學，云南 昆明 650201；2.浙江省農科院國家大麥改良中心，浙江 杭州 310021)

大麥是我國以及世界上重要的農作物之一，其種植面積和產量位列第四，是啤酒工業與飼料工業的主要原料。利用植物基因工程的原理和技術對大麥進行改良，已經引起了人們的高度重視，它將成為優質大麥新品種培育的有效新途徑之一[1-6]。與水稻、玉米等其他主要農作物相比，大麥的組織培養、植株再生非常困難，且遺傳轉化效率非常低，這嚴重阻礙了轉基因技術在培育大麥新品種的應用。所以，尋求高效能提升大麥組織培養再生率和遺傳轉化率的方法，是大麥遺傳轉化研究工作的重點。本文利用30個大麥品種對成熟胚愈傷組織誘導率和植株分化再生率等進行了研究，篩選出了大麥高組培再生率品種，對大麥遺傳轉化改良研究中品種的選擇提供了一定依據。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料有30個大麥品種：sloop、Golden promise、Metcalfe、Baudin、Gairdner、Franklin、Hamelin、Igri、Morex、云啤2號、揚農啤9號、08PJ-37青、蘇啤3號、蘇啤3號白、08PJ-37黃、浙啤33、浙大8號、浙秀12、浙秀22、浙皮8號、駐大麥5號、甘啤4號、甘啤5號、花30、墾啤麥9號、單二、秀麥11、揚飼麥3號、保大麥12號、短芒紫青稞。以上品種均由浙江省農科院國家大麥改良中心提供。

1.2 培養基

所有培養基調節pH值至5.8，無機成分和糖分均高壓蒸汽滅菌，于121℃和0.1Mpa壓力下滅菌25min。所有其余有機成分均在無菌條件下過濾滅菌，且在培養基冷卻至60℃以下加入。

1.3 取材與培養方法

將所有供試材料，用篩種機過篩，選取粒徑2.5mm級別的材料，浸泡10h，隨后置于50%(V/V)硫酸溶液中，搖床振蕩40min。將去殼的種子用75%乙醇消毒5min，12%過氧化氫溶液消毒25min，最后用滅菌水沖洗4次，每次1min。然后在無菌條件下，用解剖刀刮取種子成熟胚，將刮碎的胚組織接種到誘導培養基上，于25℃黑暗條件下誘導13d后，將初代愈傷組織轉入繼代培養基暗培養10d，再轉到MS修飾培養基1上暗培養10d，最后將愈傷組織轉移至MS修飾培養基2上進行光照分化培養(25℃、2000lx，16h/d),培養基種類見表1，30d后統計結果。

表1 培養基種類 mg

1.4 統計分析方法

每皿接種12個外植體，每個處理接種200個。每個品種3次重復。

愈傷誘導率(%)=(出愈外植體數/接種外植體數)×100

分化率(%)=(分化愈傷數/接種愈傷數)×100

再生率(%)=(出苗數/接種愈傷數)×100

綠苗率(%)=(綠苗數/接種愈傷數)×100

白化苗率(%)=(白化苗數/接種愈傷數)×100

將誘導率等百分數先用Excel進行反正弦轉換，再采用SPSS統計分析軟件進行方差分析，顯著水平α=0.05。

2 結果與分析

2.1 不同大麥品種成熟胚愈傷組織誘導

大麥成熟胚刮碎的外植體在誘導培養基上培養2～3d時，開始變白膨大，出現初級愈傷組織(圖1)。6d后刮碎接種的外植體形成愈傷組織團塊，在12d時愈傷組織形成可達到最大。初級愈傷組織一般為半透明白色，結構松軟，多成不規則片狀或球狀，含水量豐富，不具備分化再生能力。經過繼代培養的愈傷組織才具備分化、再生的能力。經過繼代培養的愈傷組織形成淡黃色球狀，表面呈現許多疣狀突起的胚性愈傷組織[7]。胚性愈傷組織具有分化和再生的能力。不同大麥品種成熟胚愈傷組織出愈率差異顯著(表2，表3)，所有供試材料中共有27個品種的出愈率超過60%，其中Golden promise、Hamelin、08PJ-37青、云啤2號和Morex的愈傷誘導率最高分別達到了93.4%、94.05%、94.75%、94.8%、94.95%，而短芒紫青稞的出愈率最低，僅為5.3%。

圖1 初代愈傷組織(彩圖見封2)

圖2 分化帶綠點的愈傷(彩圖見封2)

圖3 再生成苗(彩圖見封2)

表2 不同大麥品種成熟胚愈傷組織誘導的比較

表3 成熟胚出愈率的方差分析

2.2 不同大麥品種成熟胚愈傷組織分化和再生

在N6誘導培養基上誘導出的初代愈傷組織，轉移到MS繼代培養基上進行10d的暗培養。然后轉移到MS修飾培養基1上預分化處理10d。最后在MS修飾培養基2上光照條件下進行分化。在光照下1周，胚性愈傷組織表面分化出綠點(圖2)，繼續培養2周，其中一部分可以繼續分化形成綠苗(圖3)；而另一些愈傷組織只能保持綠點的狀態或者分化成根，不會分化成苗。不同大麥品種的分化率、再生率、綠苗形成率以及白化率均有顯著差異(見表4～8)。所有供試材料中共有24個品種的分化率超過50%，其中Franklin、蘇啤3號和浙秀22的分化率較高，分別達到了93.05%、96.3%、97.6%，而駐大麥5號的分化率最低，僅為11.85%,參見表4、表5。

在再生能力方面，不同品種間的大麥具有顯著差異。共有3個品種的再生率超過40%，6個品種再生率在30%～40%之間，6個品種在20%～30%之間，7個品種在10%～20%之間，8個品種的再生率在10%以下。其中sloop、揚農啤9號、Golden promise的再生率較高，分別達到了40.6%、43.85、44.7%，而再生率最低的墾啤麥9號僅為1.4%，參見表6、表7。

在愈傷組織分化培養的過程中，有6個品種的綠苗率在30%以上，6個品種在20%～30%之間，9個品種在10%～20%之間，9個品種的綠苗率在10%以下。其中，sloop的綠苗率最高，達到了40.6%。而綠苗率最低的墾麥啤9號僅為1.05%。

產生綠苗的同時會伴有白化苗的生成，對供試材料的白化率進行了統計分析，發現共有24個大麥品種的愈傷組織可以產生白化苗，揚農啤9號、08PJ-37青、Franklin、浙秀12、Golden promise的白化率分別為13.25%、9.85%、6.15%、5.85%、3.9%，其余品種的白化率均低于3%，參見表8。

2.3 成熟胚愈傷組織出愈率、分化率、再生率、綠苗率的相關性分析。

將以上所有各比率用SPSS軟件進行相關性分析(見表9)，發現出愈率與分化率之間的相關性達到了極顯著的水平，而出愈率與再生率以及綠苗率沒有相關性。分化率與再生率之間的相關性達到了顯著水平，分化率與綠苗率之間的相關性也達到顯著水平，再生率與綠苗率之間達到了極顯著水平的相關性。

綜合分析，品種Golden promise、浙皮8號、浙秀12、Metcalfe、Franklin、浙大8號六個品種的成熟胚組織培養再生能力較強，可以作為大麥遺傳轉化的受體進行利用。

表4 不同大麥品種成熟胚愈傷組織分化的比較

表5 成熟胚分化率的方差分析

表6 不同大麥品種成熟胚愈傷組織再生的比較

表7 成熟胚再生率、綠苗率的方差分析

表8 不同大麥品種成熟胚愈傷組織綠苗、白化苗的比較

3 討論

本研究結果表明，不同的大麥基因型成熟胚具有不同的愈傷組織誘導力。總體上說，大麥成熟胚的誘導率都高于60%。在30個品種中，出愈率高于80%的品種就有16個。郭曉琳等[9]的研究表明，在大麥成熟胚愈傷組織的誘導過程中，較高濃度的KH2PO4以及VB1可促進誘導出愈傷組織。本實驗采用的N6培養基輔以10mg/L的VB1獲得了較高的出愈率，證明了對于大麥成熟胚的組織培養來說，KH2PO4和VB1可能是兩個關鍵因素，對未來大麥成熟胚的組培研究提供了思路。

共有24個大麥品種的分化率超過了50%，最高的浙秀22達到了較高的97.6%。預分化培養基的設置，以及所含的激素配比，可能對大麥成熟胚的愈傷組織分化起到了作用。

所有的供試品種都有綠苗的再生。Sloop、Golden promise、浙啤8號、Metcalfe、甘啤4號、揚農啤9號等品種的綠苗率超過了30%，魏日鳳[8]研究了蔗糖與麥芽糖的配比對水稻成熟胚培養的作用，當有適當比例的蔗糖與麥芽糖存在時，愈傷組織的分化率和綠苗率都會有相應的提高。本研究表明，在大麥成熟胚的組織培養中，也可能有相似的作用。

從相關性分析上可以看出，出愈率與分化率之間有較為密切的相關性，而與再生率以及綠苗率沒有相關性。分化率與再生率、綠苗率之間有明確的相關性。而且再生率與綠苗率之間的相關性更為密切。其中供試材料短芒紫青稞的出愈率僅為13.3%，但該品種的分化率為45.07%，再生率以及綠苗率分別為34%、32.15%。Morex的出愈率為94.95%，在所有供試品種中是最高的，但分化率以及再生率分別為80.75%和10.75%，呈現逐漸走低的趨勢。由此可見，誘導培養基對大麥成熟胚愈傷的誘導起著關鍵的作用，而分化培養基則對大麥再生有著一定影響。因此，可根據大麥不同的品種，設計相適應的誘導培養基提高愈傷組織的出愈率，同時設計篩選合適的分化培養基，則可進一步提高大麥的分化再生能力。

表9 相關性分析

注：**在0.01水平(雙側)上顯著相關。*在0.05水平(雙側)上顯著相關。

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