NTHi肺炎小鼠肺2型與3型脫碘酶m RNA的變化

天津市兒童醫院內分泌科（天津300074） 商躍云 黃 樂 孫桂香 呂 玲 趙 彥

NTHi肺炎小鼠肺2型與3型脫碘酶m RNA的變化

天津市兒童醫院內分泌科（天津300074） 商躍云 黃 樂 孫桂香 呂 玲 趙 彥

目的：探討不可分型流感嗜血桿菌（NTHi）肺炎小鼠血三碘甲狀腺原氨酸（T3）、甲狀腺素（T4）、促甲狀腺素（TSH）及肺2型脫碘酶（D2）與3型脫碘酶（D3）m RNA水平的變化，推測肺炎并正常甲狀腺病態綜合征（ESS）的發生機制，為其治療提供理論依據。方法：C57BL／6小鼠隨機分為對照組、感染3d組、感染7d組與感染10d組。對照組取血及肺組織，感染組于制備小鼠NTHi肺炎模型后3、7及10d取血及肺組織，放射免疫分析法檢測血清T3、T4及TSH水平，實時定量聚合酶鏈反應（Real－time PCR）法測定肺D2及D3m RNA水平。數據以SPSS13.0統計軟件進行統計分析。結果：四組T3、TSH、D2及D3m RNA相對表達水平的差異有統計學意義，T4的差異無統計學意義。感染后3d T3與TSH水平低于對照組，后逐漸回升，于感染后10d其水平與對照組差異無統計學意義；與之相對應，感染后3d D3水平高于對照組，感染后7d D2水平方始高于對照組，后逐漸回落，于感染后10d仍均高于對照組，差異有統計學意義。結論：NTHi肺炎可并發ESS，D2與D3m RNA水平的變化與其發生有關。

流感嗜血桿菌（Haemophilus influenzae，Hi）分為莢膜型和無莢膜型，前者根據莢膜多糖的血清型又分為六種亞型；后者因不能與Hi莢膜多糖抗血清發生凝集反應，稱為不可分型流感嗜血桿菌（Nontypeable ha－ernophilus influenzae，NTHi）。無論發達或發展中國家，NTHi相關呼吸道感染仍是兒童呼吸系統疾病的主要原因，主要引起肺炎、會厭炎和中耳炎等［1］。嚴重的呼吸道感染多伴有正常甲狀腺病態綜合征［2］（Eu－thyroid sick syndromes，ESS），即甲狀腺功能異常，且能排除原發性甲狀腺疾病所致改變的一組綜合征，其主要表現為血清三碘甲狀腺原氨酸（Triiodothyronine，T3）水平降低并伴有反三碘甲狀腺原氨酸（Reverse triiodothyronine，r T3）升高。其發生機制尚未完全明了，推測與脫碘酶的改變有關。脫碘酶催化甲狀腺激素（Thyroid hormone，TH）在體內的脫碘代謝，是調節TH內穩態的重要因素。脫碘酶共有3種類型，即1型脫碘酶（Type 1 iodothyronine deiodinase，D1）、2 型脫碘酶（Type 2 iodothyronine deiodinase，D2）與3型脫碘酶（Type 3 iodothyronine deiodinase，D3），其中，D1與D2催化外周組織中的甲狀腺素（Thyroxine，T4）轉化為T3，即甲狀腺激素原的活化，而D3的主要作用是清除血清T3和產生r T3，即TH的滅活［3］。本研究旨在通過C57BL／6小鼠NTHi肺炎肺脫碘酶m RNA的變化推測肺炎并發ESS的發生機制，為肺炎并ESS的治療提供理論依據。

材料與方法

1 實驗材料

1.1 主要實驗儀器：二氧化碳孵箱：Thermo－Forma SeriesⅡ Water Jackcted CO2Incubator，Thermo Electron Corporation，Finland；紫外分光光度計：Smart Spec TM plus spectrophotometer，Bio－Rad，USA；電泳儀：Power Pac Basic，Bio－Rad，USA；凝膠成像系統：Chemi Doc XRS，Bio－Rad USA；Realtime PCR儀7500型：Applied Biosystems，USA。

1.2 主要試劑：T3、T4及TSH試劑盒：天津九鼎醫 學 生 物 公 司 （批 號：160445）；Trizol：Invitrogen Technoloyies Ins，USA（批號：1158824）；DEPC：天津鼎天生物技術有限公司，Sigma分裝進口（批號：D5758）；乙二胺四乙酸（EDTA）：Sigma公司（批號：083K5420）；d NTP：Fermentas（批號：9001）；Taq酶：Fermentas（批號：1005）；Oligo d（T）18：大連寶生物工程有限公司（批號：CT201C）；Ribonuclease inhibitor：大連寶生物工程有限公司（批號：CCA3901A）；DL2000 DNA Marker：大連寶生物工程有限公司（批號：CC1502）；逆轉錄酶 M－MLV：Promega（批號：19847105）；引物合成：北京奧科生物工程公司；Fast－Start Universal SYBR Green Master（Rox）：Roche，Germany（批號：04 913 914 001）。

2 實驗方法

2.1 NTHi瓊脂珠懸液的制備：將－70℃脫脂牛奶凍存菌株（ATCC 49247，肺炎患者痰標本中分離）劃線接種于哥倫比亞巧克力平板，37℃5%CO2培養24～48h，復蘇后轉種平板，分離出單個菌落。挑取平板4～5個典型菌落種入sBHI肉湯中，懸搖狀態下培養18～24h，離心收集細菌，感染緩沖液重懸，倍比稀釋，分光光度計測定吸光度，同時進行細菌計數，繪制細菌濃度標準曲線。從新鮮平板挑取菌落，接種于1 000ml sBHI液體培養基中，于37℃懸搖狀態下培養18～24h。離心收集細菌，于2×感染緩沖液中重懸，濃縮菌液，調整至細菌濃度2×109～6×109菌落形成單位（Colony－forming unit，CFU）／ml。

細菌濃縮液加熱至45℃，取濃縮菌液2ml與45℃溶化的瓊脂等量混合，45℃水浴中徹底混勻。5ml注射器吸取混合物3ml迅速注入27ml 4℃快速攪拌著的1×感染緩沖液中，形成由瓊脂包裹細菌的NTHi瓊脂珠懸液。懸浮液包含細菌濃度為1×108CFU／ml的不定形瓊脂珠。吸取30μl于0.lml注射器中，37℃保存備用。

2.2 C57BL／6小鼠NTHi肺炎模型的建立與分組：取5～6周SPF級雌性C57BL／6小鼠32只，體重15～20g（購自軍事醫學科學院），隨機分為對照組、感染3d組、感染7d組與感染10d組，每組8只，乙醚麻醉小鼠，對照組鼻腔吸入30μl空白瓊脂珠，感染組鼻腔吸入30μl 1×108CFU／ml的NTHi瓊脂珠，誘發肺部炎癥，在吸入后3、7及10d取血并處死，取肺組織備用。

2.3 T3、T4、TSH及D2D3mRNA水平的測定：血清T3、T4及TSH水平的定量測定采用放射免疫分析法。D2及D3mRNA水平的定量測定采用實時定量聚合酶鏈反應（Real time polymerase chain reaction，Realtime PCR）法，主要操作步驟如下：采用Trizol法分別提取肺組織總RNA，紫外分光光度法對其定量，吸光度260／280比值判定純度，瓊脂糖凝膠凝膠電泳檢測完整性。經逆轉錄合成cDNA后進行PCR擴增。內參照肌動蛋白（β－actin）與目的片段D2及D3的引物應用軟件Gene Runner、并根據Gen Bank所發布的目的基因序列自行設計，同時經NCBI BLAST檢索無顯著同源性。具體引物序列和擴增片段長度，見表1。

表1 Real－time PCR 引物序列

Real－time PCR反應體系參照SYBR Green Real time PCR Master Mix試劑盒說明書。PCR循環參數：95℃預變性5min，95℃變性15s，60℃退火15s，72℃延伸34s，進行40個循環。溫度變化速度為3℃／s，在每個循環延伸階段檢測熒光信號，進行實時監控，最后進入解鏈階段，繪制產物的融解曲線，以了解樣品擴增的特異性，保證測定結果的準確可靠。數據的收集由ABI 7500定量PCR儀自帶軟件完成。每管樣品重復測定4次。

3 統計學方法 采用SPSS13.0統計軟件。計量資料以±s表示，多組間比較用單因素方差分析，進一步比較采用Dunnet檢驗。

結 果

T3、T4、TSH及D2D3m RNA水平比較：四組T3、TSH、D2及D3m RNA相對表達水平的差異有統計學意義（F＝47.129、9.028、16.600、10.505，P＜0.01），T4的差異無統計學意義（F＝0.467，P＞0.05）。感染后3d T3與TSH水平低于對照組，后逐漸回升，于感染后10d其水平與對照組差異無統計學意義；與之相對應，感染后3d D3水平高于對照組，感染后7d D2水平方始高于對照組，后逐漸回落，于感染后10d其水平仍均高于對照組，差異有統計學意義，見附表。

附表 T3、T4、TSH及D2 D3 m RNA水平比較（±s，n＝8）

附表 T3、T4、TSH及D2 D3 m RNA水平比較（±s，n＝8）

注：與對照組比較＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

m RNA對照組 1.04±0.10 116.38±22.32 3.23±0.21 1.00±0.00 1.00±0.00組別 T3（μg／L） T4（μg／L） TSH（Iu／L） D2 m RNA D3 3d 0.60±0.10＊＊ 112.46±24.49 2.89±0.10＊＊ 1.01±0.11 1.59±0.34＊＊7d 0.62±0.09＊＊ 112.10±28.16 2.91±0.23＊ 1.31±0.13＊＊ 1.77±0.45＊＊10d 0.93±0.06 102.23±24.50 3.29±0.23 1.30±0.18＊＊ 1.93±0.43＊＊

討 論

NTHi是兒童肺炎的常見病原之一，嚴重感染者可并發ESS。本研究證實NTHi肺炎小鼠血清T3與TSH水平降低，T4水平改變不具有統計學意義。以往的相關研究推測其發生機制與脫碘酶的活性改變有關［4］，但尚未驗證此推斷，且并未涉及脫碘酶量的改變。本研究證實感染后D3m RNA水平首先明顯升高，TH的滅活增加，即T3水平首先迅速降低；隨后D2mRNA水平升高，D3m RNA水平逐漸回落，感染后10d仍未至對照組水平，與之相對應的是TH的活化逐漸回升，即T3水平逐漸回升。

NTHi是常見的人體共生菌，多定植于鼻咽部。共生的平衡狀態取決于宿主、微環境和微生物之間相互作用。一旦宿主、微環境和微生物之間平衡被打破，NTHi就從相對無害的共生菌變成致病菌，通過NTHi的粘附作用、誘導促炎因子釋放、逃避宿主防御等致病。NTHi粘附于粘膜和細胞外基質的能力是其在特定宿主定植的前提；釋放的游離脂寡糖是單核細胞釋放炎癥因子的強激活劑，介導細胞熱休克蛋白表達、增加肺泡巨噬細胞腫瘤壞死因子－α的生成，使中性粒細胞迅速聚集引起宿主炎癥反應，對肺部造成直接和間接損傷；同時NTHi通過多種機制來逃避宿主的防御，與機體處于共生狀態，例如NTHi可產生三類Ig A蛋白酶，均從鉸鏈區斷裂Ig A重鏈［5］。

ESS的產生與早產、營養因素、各種損傷、心力衰竭、呼吸衰竭、營養不良以及腫瘤等有關，另外，外科手術后、糖尿病、結締組織疾病等亦可致ESS［6］。

在急性炎癥的動物模型中，D2活性上調，進一步研究證實，炎癥所致的D2活性上調是通過c AMP途徑的激活調節的［7］。

出生后絕大多數正常組織中D3m RNA的表達水平很低，但在多種疾病所致ESS D3m RNA表達重新被激活，從而降低T3水平，此現象提示了D3m RNA表達水平與ESS的相關性。D3mRNA的表達水平受多種因素調控，能被促紅細胞生成素、表皮生長因子、酸性或堿性成纖維細胞生長因子、白細胞介素6等炎性因子誘導而增加其轉錄水平［8］。有研究證實急性細菌感染的小鼠模型中，被感染器官的中性粒細胞D3活性升高，T3水平顯著減少；感染的野生型小鼠與D3基因敲除的小鼠白細胞介素6與腫瘤壞死因子－α均升高，二者差異無統計學意義；然而，與野生型小鼠相比，D3基因敲除的小鼠細菌數明顯升高［9］。

D3m RNA表達水平于感染后迅速明顯升高，可致感染后TH的滅活迅速增加，T3水平降低，從而降低代謝率與耗氧量，這一現象支持傳統上認為的ESS時T3水平降低有利于能量平衡與減輕損傷。因此，有些學者認為，ESS的治療就是對原發疾病的治療，TH替代治療對ESS病人是不需要的，人為給予TH治療，提高血清TH水平到正常范圍并不能改善ESS病人的預后，相反，人為地增加機體代謝，促使機體負氮平衡，增加心臟負荷，反而會使原發疾病惡化［10］。近年發現T3降低的非甲狀腺疾病中都發現了細胞核T3受體的增多，即可能是機體組織受損的后果，故也有學者認為適時、適量、短期應用TH替代治療可改善癥狀，減少并發癥的發生，促進病情的恢復［11］。根據本研究結果，由于感染后D3m RNA水平升高，即TH滅活增加，對于NTHi肺炎并發的ESS TH替代治療是否對局部TH水平有影響尚有待商榷，是否可改善預后尚有待進一步的研究及長期隨訪。

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Changes of type 2 and type 3 iodothyronine deiodinase mRNA in lungs of mice of NTHi pneumonia

Department of Endocrinology of Tianjin Children’s Hospital（Tianjin 300074）Shang Yueyun Huang Le Sun Guixiang et al

Objective：To explore the changes of T3，T4and TSH levels in serum and type 2 iodothyronine deiodinase（D2）and type 3 iodothyronine deiodinase（D3）m RNA levels in lungs of mice of nontypeable haernophilus influenza（NTHi）pneumonia，to speculate on mechanisms of pneumonia and euthyroid sick syndromes（ESS）and to provide theoretical basis to the treatment.Methods：C57BL／6 mice were randomly divided into control group，3 days after infection group，7 days after infection group and 10 days after infection group.Blood samples and lungs were taken 3，7 and 10 days after establishment of NTHi pneumonia model，T3，T4and TSH levels in serum were detected by radioimmunoassay method and D2and D3m RNA levels in lungs were measured by real time polymerase chain reaction（Real－time PCR）.The data were statistically analyzed by SPSS13.0 software package.Results：There were statistical differences of T3、TSH、D2and D3m RNA levels among the 4 groups（F＝47.129、9.028、16.600、10.505，while there was no statistical difference of T4levels among the 4 groups（F＝0.467）.T3and TSH levels of 3 days after infection group were lower than control group，and then picked up gradually，there was no statistical differences between 10 days after infection group and control group；correspondingly，D3level of 3 days after infection group was higher than control group and D2level of 7 days after infection group was higher than control group and then gradually dropped，but both were still higher than control group 10 days after infection，the differences were statistically significant.Conclusion：ESS may occur as complication of NTHi pneumonia and changes of D2and D3m RNA profiles involve in it.

Haemophilus influenzae／enzymology Pneumonia／immunology ＠Type 2 iodothyronine deiodinase ＠Type 3 iodothyronine deiodinase ＠Euthyroid sick syndromes Mice

流感嗜血菌／酶學 肺炎／免疫學 ＠2型脫碘酶 ＠3型脫碘酶 ＠非甲狀腺疾病病態綜合征 小鼠

R392.3

A

1000－7377（2012）03－0272－04

（收稿：2011－07－15）