超聲波輔助提取羊棲菜巖藻黃質(zhì)的工藝優(yōu)化

劉麗平，奚歆兒，汪財(cái)生，李彩燕，錢國(guó)英

(1.浙江理工大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，浙江杭州 310018;2.浙江萬(wàn)里學(xué)院 生物與環(huán)境學(xué)院，浙江寧波 315100)

巖藻黃質(zhì) (fucoxanthin)又稱巖藻黃素、褐藻黃素，屬于類胡蘿卜素中的葉黃素類，廣泛存在于各種藻類、海洋浮游植物、水生貝殼類等動(dòng)植物中［1-2］，其結(jié)構(gòu)式見圖1。國(guó)內(nèi)外有關(guān)研究證明，巖藻黃質(zhì)具有抗氧化、抗癌，增加小鼠體內(nèi)的DHA和ARA含量等功能［3-5］。巖藻黃質(zhì)作為藥物、保健品及護(hù)膚美容產(chǎn)品將具有廣闊的應(yīng)用前景。目前，國(guó)內(nèi)外關(guān)于巖藻黃質(zhì)的研究多取材于海帶和裙帶菜，而以羊棲菜為材料提取巖藻黃質(zhì)鮮有報(bào)道。

近年來(lái)，巖藻黃質(zhì)的提取多采用溶劑浸提法［6-11］，其次是超臨界 CO2萃取法［12-13］。超聲波輔助提取巖藻黃質(zhì)研究甚少［14］。因此，本研究選取羊棲菜為原料，采用響應(yīng)面法優(yōu)化超聲波輔助乙醇和丙酮混合溶劑提取巖藻黃質(zhì)的工藝條件，探討羊棲菜中巖藻黃質(zhì)的提取率，為提高其經(jīng)濟(jì)附價(jià)值、工業(yè)化生產(chǎn)巖藻黃質(zhì)產(chǎn)品提供理論及技術(shù)參考。

圖1 Fucoxanthin結(jié)構(gòu)式

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

羊棲菜購(gòu)于浙江溫州洞頭縣5-6月新鮮藻體，清水沖洗藻體表面泥沙、鹽粒，瀝干后于-20℃冰柜中儲(chǔ)藏。實(shí)驗(yàn)前取冰凍藻體真空冷凍干燥，粉碎過(guò)60目篩于-20℃冰箱中避光密封保存?zhèn)溆谩?/p>

ALPHA1-4/2-4LSC型冷凍干燥機(jī) (德國(guó)Christ)，F(xiàn)W100高速萬(wàn)能粉碎機(jī) (天津泰斯特)，Agilent-1100型高效液相色譜儀 (美國(guó) Agilent)，YJ96-ⅡN超聲波細(xì)胞粉碎機(jī) (寧波甬杰)，巖藻黃質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品 (Sigma公司，020M1541)，甲醇、乙腈(色譜純)，其余試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 羊棲菜巖藻黃質(zhì)提取基礎(chǔ)工藝

稱取10 g羊棲菜干粉于燒杯中，加入一定體積的乙醇和丙酮3∶1(V/V)混合溶液浸提2 h后，置于超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)中輔助提取，控制溫度65℃［11］，將提取液在4℃冷凍離心機(jī)中5 000 r·min-1離心5 min，上清液置于真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中0.1 Mpa避光濃縮，回收溶劑后，冷凍干燥得巖藻黃質(zhì)粗品。

1.2.2 超聲波輔助提取單因素試驗(yàn)

根據(jù)1.2.1的提取工藝流程，分別稱取一定量的羊棲菜粉末，在不同超聲時(shí)間 (5，10，15，20，25 min)、超聲功率 (200，300，400，500，600 W) 和 液 料 比 (20，30，40，50，60 mL·g-1)的條件下進(jìn)行單因素試驗(yàn)，考察超聲波輔助提取主要因素對(duì)巖藻黃質(zhì)提取率的影響，重復(fù)3次，取平均值。

1.2.3 響應(yīng)面法優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)

為了在現(xiàn)有實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上尋找到整個(gè)區(qū)域上因素的最佳組合和響應(yīng)值的最優(yōu)值，根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，按1.2.1工藝流程，以羊棲菜巖藻黃質(zhì)提取率為響應(yīng)值，超聲時(shí)間、超聲功率和料液比3個(gè)因素為自變量，采用Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)3因素3水平17個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)的響應(yīng)面分析試驗(yàn)，考察不同因素及其交互作用對(duì)羊棲菜巖藻黃質(zhì)提取率的影響，借助試驗(yàn)設(shè)計(jì)軟件Design Expert(version 7.0.0)對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析，以確定最佳提取工藝參數(shù)組合，并對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。因素水平編碼見表1。

表1 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平及其編碼

1.2.4 巖藻黃質(zhì)含量及提取率分析

巖藻黃質(zhì)含量的檢測(cè)參考尹尚軍等［11］的HPLC方法，配制 1，2，4，8，16，32，64，128μg·mL-1系列濃度的巖藻黃質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液，于液相色譜D450nm下檢測(cè)分析，得回歸方程。將提取巖藻黃質(zhì)的上清液定容至一定體積，取樣進(jìn)行HPLC分析。

巖藻黃質(zhì)提取率/mg·g-1=m1/M，

粗品得率/%=m2/M×100，

純度/%=(m1/1 000)/m2×100。

m1為樣品溶液中巖藻黃質(zhì)含量 (mg)，m2為樣品溶液經(jīng)真空濃縮干燥得粗品質(zhì)量 (g)，M為樣品溶液中羊棲菜干粉質(zhì)量 (g)。

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測(cè)巖藻黃質(zhì)含量回歸方程的建立

按照1.2.4的方法得回歸方程Y=170.39X+13.341(R2=0.999 6)，表明巖藻黃質(zhì)在1～128 μg·mL-1范圍內(nèi)與峰面積呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，可用來(lái)檢測(cè)樣品巖藻黃質(zhì)含量。

2.2 單因素試驗(yàn)

2.2.1 超聲時(shí)間對(duì)巖藻黃質(zhì)提取率的影響

采用單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)，在超聲功率300 W，液料比30 mL·g-1的條件下，研究不同提取時(shí)間對(duì)巖藻黃質(zhì)提取率的影響。由圖2可知，隨著樣品超聲時(shí)間的延長(zhǎng)，羊棲菜中巖藻黃質(zhì)提取率增高趨緩，20 min時(shí)達(dá)到峰值 (1.007 mg·g-1)，之后提取率呈現(xiàn)降低趨勢(shì)?？赡苁怯捎趲r藻黃質(zhì)主要存在于細(xì)胞間和細(xì)胞壁中，超聲時(shí)間處理太短不足以破碎細(xì)胞，釋放色素;時(shí)間太長(zhǎng)，則超聲波的機(jī)械剪切力對(duì)巖藻黃質(zhì)有一定的降解和破壞作用，使巖藻黃質(zhì)含量降低。該結(jié)果與趙鵬［14］對(duì)海帶中巖藻黃質(zhì)提取的超聲時(shí)間試驗(yàn)比較，提取率趨勢(shì)一致，但其超聲最佳時(shí)間在60 min時(shí)，這可能與不同海藻材料細(xì)胞壁的致密性不一致有關(guān)，造成超聲處理時(shí)間有一定區(qū)別。

圖2 超聲時(shí)間對(duì)巖藻黃質(zhì)提取率的影響

2.2.2 超聲功率對(duì)超聲波輔助提取羊棲菜巖藻黃質(zhì)提取率的影響

采用單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)，在超聲時(shí)間10 min，液料比30 mL·g-1的條件下，研究不同提取功率對(duì)巖藻黃質(zhì)提取率的影響 (圖3)。隨著超聲功率加大，熱效應(yīng)增強(qiáng)，巖藻黃質(zhì)提取率隨之明顯增高，至500 W時(shí)提取率達(dá)到峰值 (1.008 mg·g-1)，此時(shí)強(qiáng)烈的空化作用瞬間造成細(xì)胞壁破碎加速羊棲菜各種色素有效成分的溶出、擴(kuò)散。隨后超聲功率提高至600 W時(shí)，巖藻黃質(zhì)提取率下降為0.876 mg·g-1，表明應(yīng)用超聲波提取該色素，超聲強(qiáng)度和空化作用的影響有一定的范圍，即超聲功率在200～500 W范圍內(nèi)巖藻黃質(zhì)較穩(wěn)定。試驗(yàn)表明，功率選擇500 W左右時(shí)，羊棲菜巖藻黃質(zhì)的溶出可能達(dá)到飽和。

圖3 超聲功率對(duì)巖藻黃質(zhì)提取率的影響

2.2.3 液料比對(duì)超聲波輔助提取羊棲菜巖藻黃質(zhì)的影響

采用單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)，在超聲功率500 W，超聲時(shí)間10 min的條件下，研究不同液料比對(duì)巖藻黃質(zhì)提取率的影響，結(jié)果如圖4所示。隨液料比的增大，巖藻黃質(zhì)提取率越高，當(dāng)液料比為40 mL·g-1時(shí)達(dá)1.001 mg·g-1，之后巖藻黃質(zhì)提取率增大幅度減小，幾乎不再變化。說(shuō)明液料比達(dá)到一定值時(shí)溶劑將巖藻黃質(zhì)幾乎完全溶出。再增大液料比，巖藻黃質(zhì)的提取率也不會(huì)明顯增大。一般來(lái)說(shuō)，增加溶劑的比例有利于傳質(zhì)擴(kuò)散，但在實(shí)際操作中溶劑體積過(guò)大，會(huì)增加生產(chǎn)成本，不利于后續(xù)的濃縮，并影響超聲波在介質(zhì)中傳遞的有效范圍減小。因此，提取羊棲菜巖藻黃質(zhì)時(shí)，液料比應(yīng)考慮40 mL·g-1左右為宜。

圖4 液料比對(duì)巖藻黃質(zhì)提取率的影響

2.3 響應(yīng)曲面試驗(yàn)結(jié)果及方程的建立

應(yīng)用響應(yīng)曲面法優(yōu)化提取條件的試驗(yàn)結(jié)果如表2所示。

表2 Box-Behnken設(shè)計(jì)及其實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由響應(yīng)曲面模型的方差分析表 (表3)可見，所建立的模型因素水平極顯著 (P＜0.01)，失擬值為0.075 8(P＞0.05)，表明由誤差引起的失擬不顯著。模型確定系數(shù)值為0.963 1，說(shuō)明模型可以解釋96.31%試驗(yàn)所得巖藻黃質(zhì)提取率的變化，表明方程擬合較好。校正確定系數(shù)為0.915 7，表明巖藻黃質(zhì)提取率91.57%的變異分布在方程的9個(gè)因子中，其總變異中僅有8.43%不能由該模型解釋。表明該模型方程因變量與全體自變量間線性關(guān)系明顯，模型的變異系數(shù)值為4.22%，說(shuō)明模型精密度較好。綜合以上各參數(shù)表明該實(shí)驗(yàn)方法可靠，各因素水平間設(shè)計(jì)合理，模型方程能較好地反映羊棲菜巖藻黃質(zhì)提取率與超聲時(shí)間、超聲功率及液料比之間的變化規(guī)律關(guān)系。因此可用該回歸模型預(yù)測(cè)羊棲菜巖藻黃質(zhì)提取率的結(jié)果。

表3 回歸模型的方差分析

表3中模型的方差分析表顯示，模型一次項(xiàng)A、B及二次項(xiàng)A、B及交互項(xiàng)AC對(duì)巖藻黃質(zhì)提取率線性和曲面效應(yīng)影響極顯著 (P﹤0.01)，一次項(xiàng)C和二次項(xiàng)C影響顯著 (P﹤0.05)，交互項(xiàng)AB和 BC影響不顯著 (P﹥0.05)。通過(guò) Design Expert 7.0.0軟件對(duì)表2的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多項(xiàng)回歸擬合，為了使方程具有更好的擬合性，把一些統(tǒng)計(jì)分析不顯著 (P﹥0.05)項(xiàng) (包括AB和BC)從方程中除去，得到優(yōu)化的二次回歸方程如下:

Y=1.184+0.072A+0.086B-0.043C+0.082AC-0.102A2-0.164B2-0.073C2。

其中，Y為巖藻黃質(zhì)提取率的預(yù)測(cè)值，A、B、C分別為影響巖藻黃質(zhì)提取的超聲時(shí)間、超聲功率及液料比的編碼值。方程中各項(xiàng)系數(shù)絕對(duì)值的大小直接反映了各因素對(duì)巖藻黃質(zhì)提取率的影響程度，系數(shù)的正負(fù)反映了影響的方向。

2.4 響應(yīng)曲面分析及工藝條件的確定和驗(yàn)證

圖5-7直觀地反映了各因素對(duì)巖藻黃質(zhì)提取率的影響。

各因素間響應(yīng)曲面圖開口向下，隨著每個(gè)因素水平的增大，響應(yīng)值增大;響應(yīng)值達(dá)極值后，隨著每個(gè)因素水平的增大，響應(yīng)值減小。其中，超聲功率對(duì)巖藻黃質(zhì)提取率影響最大，其次是超聲時(shí)間，且超聲時(shí)間和液料比間交互作用對(duì)巖藻黃質(zhì)提取率的影響最顯著。

圖5 超聲時(shí)間和超聲功率對(duì)巖藻黃質(zhì)提取率的影響

圖6 超聲時(shí)間和液料比對(duì)巖藻黃質(zhì)提取率的影響

通過(guò)Design Expert 7.0.0軟件分析得出，超聲波輔助提取羊棲菜巖藻黃質(zhì)最佳條件為超聲時(shí)間21.74 min，超聲功率 528.52 W，液料比 39.07 mL·g-1，其理論預(yù)測(cè)巖藻黃質(zhì)提取率為 1.211 mg·g-1?？紤]實(shí)際的可操作性，調(diào)整超聲時(shí)間22 min，超聲功率530 W，液料比40 mL·g-1為最佳條件。按此工藝條件進(jìn)行多次驗(yàn)證得到巖藻黃質(zhì)的平均提取率為 1.202 mg·g-1，與模型預(yù)測(cè)值(1.210 57 mg·g-1)較接近，充分反映了響應(yīng)曲面模型的有效性及其強(qiáng)大的分析能力，可為實(shí)際操作提供良好的指導(dǎo)。此條件下，巖藻黃質(zhì)提取率是尹尚軍等［11］報(bào)道的溶劑浸提羊棲菜巖藻黃質(zhì)的約1.2倍，是趙鵬［14］超聲波輔助提取海帶巖藻黃質(zhì)的約3.5倍。此外，該優(yōu)化條件下，巖藻黃質(zhì)粗品得率可達(dá)2.68%，純度為2.02%。

圖7 超聲功率和液料比對(duì)巖藻黃質(zhì)提取率的影響

3 小結(jié)與展望

響應(yīng)曲面法優(yōu)化超聲波輔助提取羊棲菜巖藻黃質(zhì)的最佳工藝條件為:控制超聲溫度65℃，以乙醇和丙酮3∶1(V/V)為溶劑，超聲時(shí)間22 min，功率530 W，液料比40 mL·g-1。此條件下，巖藻黃質(zhì)的提取率1.202 mg·g-1，粗品得率2.68%，純度2.02%?？梢?，超聲波輔助提取羊棲菜巖藻黃質(zhì)效果顯著高于溶劑浸提法，可為巖藻黃質(zhì)的工業(yè)化生產(chǎn)提供理論參考。并提示羊棲菜中巖藻黃質(zhì)的含量遠(yuǎn)比海帶豐富，極具開發(fā)價(jià)值。但關(guān)于巖藻黃質(zhì)的分離純化尚需進(jìn)一步研究。

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