固相萃取-液相色譜法測(cè)定柑橘中百可得殘留量

石守江，樊東波，葛宣寧

(浙江省寧海出入境檢驗(yàn)檢疫局，浙江 寧海 315600)

柑橘作為世界第1大水果［1］，在全世界得到了普遍推廣和種植。2002全世界年貿(mào)易額達(dá)到82億多美元，是僅次于小麥和玉米的第3大貿(mào)易農(nóng)產(chǎn)品。柑橘在世界140個(gè)國(guó)家和地區(qū)有栽培，其中主要集中在巴西、美國(guó)、中國(guó)以及地中海沿岸的國(guó)家。我國(guó)雖然經(jīng)歷了10多年的品種結(jié)構(gòu)調(diào)整，但中熟品種過(guò)多、晚熟品種過(guò)少、成熟期集中的產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)仍無(wú)根本性改變。我國(guó)柑橘83%以上都集中在11-12月上市。由于成熟期集中，柑橘的保鮮一直是困擾橘農(nóng)的主要技術(shù)難題之一。目前柑橘保鮮劑種類繁多，保鮮效果各有特色。百可得作為新型廣譜殺菌保鮮劑，對(duì)真菌的類酯化合物的生物合成和細(xì)胞膜機(jī)能起作用，抑制孢子萌發(fā)、芽管伸長(zhǎng)、附著胞和菌絲的形成，對(duì)大多數(shù)由子囊菌和半知菌引起的真菌病害有很好的效果，所以百可得在國(guó)內(nèi)外得到廣泛的應(yīng)用［2］。

百可得中文通用名為雙胍三辛烷基苯磺酸鹽，化學(xué)名為1＇1-亞氨基 (辛基亞甲基)雙胍3(烷基苯基磺酸鹽)，CAS NO為99257-43-9，分子式為C72H131N7O9S3，是雙胍鹽類單一分子結(jié)構(gòu)的新型殺菌保鮮劑。

百可得作為一種低毒藥品，目前國(guó)內(nèi)沒(méi)有規(guī)定其在農(nóng)作物上的最高允許殘留限量，但在日本肯定列表規(guī)定其最大允許殘留限量為0.2 mg·kg-1。由于目前沒(méi)有一種快速、靈敏、簡(jiǎn)單的檢測(cè)方法，故百可得殘留量將對(duì)中國(guó)產(chǎn)柑橘及其制品的出口帶來(lái)一定的影響。柑橘中百可得檢測(cè)在國(guó)內(nèi)外報(bào)道不多，目前主要有液相色譜法檢測(cè)［3］。該方法前處理步驟復(fù)雜，而且檢測(cè)過(guò)程需要進(jìn)行柱后衍生，且檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)，因而對(duì)實(shí)驗(yàn)效率造成一定的影響。固相萃取-液相色譜法能快速靈敏地檢測(cè)柑橘中的百可得含量，為柑橘中百可得殘留量檢測(cè)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

柑橘采自寧波國(guó)盛農(nóng)場(chǎng)果園中，熟度七到八成;百可得標(biāo)準(zhǔn)品為德國(guó)D.r公司，純度99.5%;甲醇、乙腈、正己烷為色譜純，美國(guó)天地公司;四丁基溴化銨、磷酸、氨水為分析純，上海國(guó)藥集團(tuán);固相萃取柱;ProElut PWA 60 mg/3 mL，迪馬科技公司。

1.2 儀器與設(shè)備

1200型高效液相色譜儀 (美國(guó)Agilent公司)，固相萃取裝置 (美國(guó) Caliper公司)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(瑞士BUICH公司)，高速離心機(jī) (英國(guó)Centurion公司)，超純水器 (美國(guó)Mi1lipore公司)，超聲波儀(昆山超聲儀器有限公司)，均質(zhì)機(jī) (德國(guó) IKA公司)。

1.3 方法

1.3.1 液相色譜條件

液相色譜柱 XDB-C18(4.6 mm×150 mm，5μm)，流動(dòng)相pH值4.5的0.1%四丁基溴化銨水溶液-乙腈 (85∶15)，流速 1.0 mL·min-1，柱溫40℃，定量方法采用外標(biāo)法，進(jìn)樣量20μL，檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm。

1.3.2 樣品提取

稱取均質(zhì)樣品5.0 g，加入30 mL甲醇，旋渦振蕩提取1 min，再在40℃超聲波超聲提取20 min，6 000 r·min-1離心 5 min，取出上層提取液，再加入10 mL甲醇，重復(fù)提取10 min，合并甲醇提取液。

1.3.3 凈化

用3 mL甲醇將PWA固相萃取柱活化，再用3 mL 2%甲酸水溶液平衡，加入10 mL樣品溶液，流速為1.0 mL·min-1;用3 mL 2%甲酸水溶液和3 mL甲醇淋洗;再用3 mL 5%氨水甲醇溶液洗脫，流速為1.0 mL·min-1，收集洗脫液，在40℃下濃縮并用甲醇溶解定容到2 mL，過(guò)0.45μm濾膜，上機(jī)檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

2.1.1 提取溶劑

根據(jù)文獻(xiàn)查詢，百可得在溶劑中的溶解度;甲醇5 660 g·L-1、乙醇3 280 g·L-1、異丙醇1 800 g·L-1、苯0.02 g·L-1。前3種溶劑均能很好溶解百可得，但考慮到最大溶解度和最終的樣品濃縮需要，本方法選擇甲醇作為萃取溶劑。

2.1.2 提取溫度

在20℃，30℃，40℃，50℃，60℃下分別提取20 min。結(jié)果表明，提取溫度低于30℃時(shí)，提取效率低，而高于50℃溶劑的揮發(fā)比較嚴(yán)重，且雜質(zhì)提取增多。因此比較合適的提取溫度為40℃。

2.1.3 提取時(shí)間

在提取溫度40℃下，用40 mL溶劑進(jìn)行5，10，20，30，40 min提取時(shí)間的平行試驗(yàn)。結(jié)果表明，在超過(guò)30 min后，提取液中百可得的含量隨提取時(shí)間的延長(zhǎng)沒(méi)有很明顯的變化，相反提取時(shí)間的延長(zhǎng)加深了提取液顏色，不利于凈化。若將溶劑分成2份，分2次各進(jìn)行20 min和10 min提取，提取效果優(yōu)于單次30 min，故確定進(jìn)行2次提取。

2.1.4 提取設(shè)備

分別用超聲波、旋渦振蕩和回旋振蕩器進(jìn)行萃取30 min。結(jié)果表明，3種萃取條件下的回收率分別為85%，71%和55%，故采取旋渦結(jié)合超聲波進(jìn)行萃取。

2.2 色譜分離圖及標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)工作液的配制

200 mg·kg-1標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液:分別稱量經(jīng)折算相當(dāng)于20 mg(精確到0.1 mg)的百可得標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，用甲醇溶解并定容于100 mL容量瓶中，在4℃下避光存放。

標(biāo)準(zhǔn)工作溶液:標(biāo)準(zhǔn)工作溶液根據(jù)使用前需要將儲(chǔ)備液稀釋進(jìn)行配制。分別配制成質(zhì)量濃度為0.00，0.05，0.10，1.00，10.00，50.00 mg·L-1的系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，在上述色譜條件下檢測(cè)。以檢測(cè)得到的液相色譜峰的峰面積y為縱坐標(biāo)，相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品濃度mg·L-1為橫坐標(biāo)，分別繪制百可得的標(biāo)準(zhǔn)曲線，擬合計(jì)算得到標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程式及相關(guān)系數(shù)。百可得的標(biāo)準(zhǔn)曲線呈良好的直線關(guān)系，其線性方程式為:

y=1.344 9x-0.157 5，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 9，此時(shí)百可得的最小檢出量為0.05 mg·kg-1。

色譜分離圖 (圖1)表明，百可得的色譜分離情況良好，且沒(méi)有雜峰干擾。說(shuō)明所選擇的色譜檢測(cè)條件可行，此時(shí)百可得的保留時(shí)間為2.007 min。

圖1 百可得標(biāo)準(zhǔn)品的色譜分離結(jié)果

2.2.2 方法回收率和精密度

分別準(zhǔn)確秤取16份已制備好的柑橘樣品，每份5.0 g，放入150 mL具塞三角瓶中。將樣品分3組，每組5份樣品中分別加入百可得標(biāo)準(zhǔn)溶液使最終濃度分別為0.100，1.000，10.000 mg·L-1，另1份為樣品空白。將標(biāo)準(zhǔn)品添加后搖勻后靜置30 min，提取、凈化和檢測(cè)，計(jì)算回收率及變異系數(shù) (表1)。

表1 回收率和變異系數(shù) (n=5)

表1結(jié)果表明，當(dāng)百可得在柑橘中的添加濃度在0.100～10.000 mg·L-1時(shí)，其添加回收率為85.40%～98.52%，添加回收試驗(yàn)均符合農(nóng)藥殘留量檢 測(cè) 的 技 術(shù) 要 求［4-5］。變 異 系 數(shù) 0.82% ～5.28%，符合農(nóng)殘分析測(cè)定允許的公差范圍。這說(shuō)明所選擇的分析檢測(cè)方法可以用于百可得的殘留分析與檢測(cè)。

3 小結(jié)

通過(guò)添加回收率試驗(yàn)，借助HPLC技術(shù)，建立了適合柑橘樣品中百可得殘留量分析與檢測(cè)的方法。該方法較為簡(jiǎn)便，準(zhǔn)確度、重現(xiàn)性和精確度都符合農(nóng)藥殘留量分析與檢測(cè)的要求，可用于對(duì)實(shí)際樣品中百可得殘留量的分析與檢測(cè)。本文所采用的HPLC法與國(guó)內(nèi)其他采用液相色譜法檢測(cè)相比，具有檢測(cè)速度快、檢出限低、精密度好、準(zhǔn)確度高的特點(diǎn)，為百可得在水果保鮮的應(yīng)用風(fēng)險(xiǎn)和食品安全提供了必要的技術(shù)支持。

［1］ 吳厚玖.中國(guó)柑橘加工現(xiàn)狀及其發(fā)展前景［J］.中國(guó)南方果樹，2001，30(4):19-20.

［2］ 王鴻飛，莊榮玉.百可得對(duì)溫州柑橘的保鮮.寧波大學(xué)學(xué)報(bào) ［J］，2000:13(1):88-91.

［3］ 吳珉，李振，胡秀卿，等.高效液相色譜法測(cè)定番茄與土壤中雙胍三辛烷苯基磺酸鹽殘留量［J］.農(nóng)藥，2006，45(11):775-777.

［4］ 樊德方.農(nóng)藥殘留分析與檢測(cè)［M］.上海:上海科學(xué)技術(shù)出版社，1982:116-139.

［5］ 農(nóng)業(yè)部農(nóng)藥檢定所.農(nóng)藥殘留實(shí)用檢測(cè)方手冊(cè) (一)［M］.北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)科技出版社，1995:7-35.