固相萃取-液相色譜法測定柑橘中百可得殘留量

石守江，樊東波，葛宣寧

(浙江省寧海出入境檢驗檢疫局，浙江 寧海 315600)

柑橘作為世界第1大水果［1］，在全世界得到了普遍推廣和種植。2002全世界年貿易額達到82億多美元，是僅次于小麥和玉米的第3大貿易農產品。柑橘在世界140個國家和地區有栽培，其中主要集中在巴西、美國、中國以及地中海沿岸的國家。我國雖然經歷了10多年的品種結構調整，但中熟品種過多、晚熟品種過少、成熟期集中的產業結構仍無根本性改變。我國柑橘83%以上都集中在11-12月上市。由于成熟期集中，柑橘的保鮮一直是困擾橘農的主要技術難題之一。目前柑橘保鮮劑種類繁多，保鮮效果各有特色。百可得作為新型廣譜殺菌保鮮劑，對真菌的類酯化合物的生物合成和細胞膜機能起作用，抑制孢子萌發、芽管伸長、附著胞和菌絲的形成，對大多數由子囊菌和半知菌引起的真菌病害有很好的效果，所以百可得在國內外得到廣泛的應用［2］。

百可得中文通用名為雙胍三辛烷基苯磺酸鹽，化學名為1＇1-亞氨基 (辛基亞甲基)雙胍3(烷基苯基磺酸鹽)，CAS NO為99257-43-9，分子式為C72H131N7O9S3，是雙胍鹽類單一分子結構的新型殺菌保鮮劑。

百可得作為一種低毒藥品，目前國內沒有規定其在農作物上的最高允許殘留限量，但在日本肯定列表規定其最大允許殘留限量為0.2 mg·kg-1。由于目前沒有一種快速、靈敏、簡單的檢測方法，故百可得殘留量將對中國產柑橘及其制品的出口帶來一定的影響。柑橘中百可得檢測在國內外報道不多，目前主要有液相色譜法檢測［3］。該方法前處理步驟復雜，而且檢測過程需要進行柱后衍生，且檢測時間長，因而對實驗效率造成一定的影響。固相萃取-液相色譜法能快速靈敏地檢測柑橘中的百可得含量，為柑橘中百可得殘留量檢測提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

柑橘采自寧波國盛農場果園中，熟度七到八成;百可得標準品為德國D.r公司，純度99.5%;甲醇、乙腈、正己烷為色譜純，美國天地公司;四丁基溴化銨、磷酸、氨水為分析純，上海國藥集團;固相萃取柱;ProElut PWA 60 mg/3 mL，迪馬科技公司。

1.2 儀器與設備

1200型高效液相色譜儀 (美國Agilent公司)，固相萃取裝置 (美國 Caliper公司)，旋轉蒸發儀(瑞士BUICH公司)，高速離心機 (英國Centurion公司)，超純水器 (美國Mi1lipore公司)，超聲波儀(昆山超聲儀器有限公司)，均質機 (德國 IKA公司)。

1.3 方法

1.3.1 液相色譜條件

液相色譜柱 XDB-C18(4.6 mm×150 mm，5μm)，流動相pH值4.5的0.1%四丁基溴化銨水溶液-乙腈 (85∶15)，流速 1.0 mL·min-1，柱溫40℃，定量方法采用外標法，進樣量20μL，檢測波長280 nm。

1.3.2 樣品提取

稱取均質樣品5.0 g，加入30 mL甲醇，旋渦振蕩提取1 min，再在40℃超聲波超聲提取20 min，6 000 r·min-1離心 5 min，取出上層提取液，再加入10 mL甲醇，重復提取10 min，合并甲醇提取液。

1.3.3 凈化

用3 mL甲醇將PWA固相萃取柱活化，再用3 mL 2%甲酸水溶液平衡，加入10 mL樣品溶液，流速為1.0 mL·min-1;用3 mL 2%甲酸水溶液和3 mL甲醇淋洗;再用3 mL 5%氨水甲醇溶液洗脫，流速為1.0 mL·min-1，收集洗脫液，在40℃下濃縮并用甲醇溶解定容到2 mL，過0.45μm濾膜，上機檢測。

2 結果與分析

2.1 前處理條件的優化

2.1.1 提取溶劑

根據文獻查詢，百可得在溶劑中的溶解度;甲醇5 660 g·L-1、乙醇3 280 g·L-1、異丙醇1 800 g·L-1、苯0.02 g·L-1。前3種溶劑均能很好溶解百可得，但考慮到最大溶解度和最終的樣品濃縮需要，本方法選擇甲醇作為萃取溶劑。

2.1.2 提取溫度

在20℃，30℃，40℃，50℃，60℃下分別提取20 min。結果表明，提取溫度低于30℃時，提取效率低，而高于50℃溶劑的揮發比較嚴重，且雜質提取增多。因此比較合適的提取溫度為40℃。

2.1.3 提取時間

在提取溫度40℃下，用40 mL溶劑進行5，10，20，30，40 min提取時間的平行試驗。結果表明，在超過30 min后，提取液中百可得的含量隨提取時間的延長沒有很明顯的變化，相反提取時間的延長加深了提取液顏色，不利于凈化。若將溶劑分成2份，分2次各進行20 min和10 min提取，提取效果優于單次30 min，故確定進行2次提取。

2.1.4 提取設備

分別用超聲波、旋渦振蕩和回旋振蕩器進行萃取30 min。結果表明，3種萃取條件下的回收率分別為85%，71%和55%，故采取旋渦結合超聲波進行萃取。

2.2 色譜分離圖及標準曲線

2.2.1 標準工作液的配制

200 mg·kg-1標準儲備溶液:分別稱量經折算相當于20 mg(精確到0.1 mg)的百可得標準物質，用甲醇溶解并定容于100 mL容量瓶中，在4℃下避光存放。

標準工作溶液:標準工作溶液根據使用前需要將儲備液稀釋進行配制。分別配制成質量濃度為0.00，0.05，0.10，1.00，10.00，50.00 mg·L-1的系列標準工作溶液，在上述色譜條件下檢測。以檢測得到的液相色譜峰的峰面積y為縱坐標，相應的標準品濃度mg·L-1為橫坐標，分別繪制百可得的標準曲線，擬合計算得到標準品的標準曲線方程式及相關系數。百可得的標準曲線呈良好的直線關系，其線性方程式為:

y=1.344 9x-0.157 5，相關系數R2=0.999 9，此時百可得的最小檢出量為0.05 mg·kg-1。

色譜分離圖 (圖1)表明，百可得的色譜分離情況良好，且沒有雜峰干擾。說明所選擇的色譜檢測條件可行，此時百可得的保留時間為2.007 min。

圖1 百可得標準品的色譜分離結果

2.2.2 方法回收率和精密度

分別準確秤取16份已制備好的柑橘樣品，每份5.0 g，放入150 mL具塞三角瓶中。將樣品分3組，每組5份樣品中分別加入百可得標準溶液使最終濃度分別為0.100，1.000，10.000 mg·L-1，另1份為樣品空白。將標準品添加后搖勻后靜置30 min，提取、凈化和檢測，計算回收率及變異系數 (表1)。

表1 回收率和變異系數 (n=5)

表1結果表明，當百可得在柑橘中的添加濃度在0.100～10.000 mg·L-1時，其添加回收率為85.40%～98.52%，添加回收試驗均符合農藥殘留量檢 測 的 技 術 要 求［4-5］。變 異 系 數 0.82% ～5.28%，符合農殘分析測定允許的公差范圍。這說明所選擇的分析檢測方法可以用于百可得的殘留分析與檢測。

3 小結

通過添加回收率試驗，借助HPLC技術，建立了適合柑橘樣品中百可得殘留量分析與檢測的方法。該方法較為簡便，準確度、重現性和精確度都符合農藥殘留量分析與檢測的要求，可用于對實際樣品中百可得殘留量的分析與檢測。本文所采用的HPLC法與國內其他采用液相色譜法檢測相比，具有檢測速度快、檢出限低、精密度好、準確度高的特點，為百可得在水果保鮮的應用風險和食品安全提供了必要的技術支持。

［1］ 吳厚玖.中國柑橘加工現狀及其發展前景［J］.中國南方果樹，2001，30(4):19-20.

［2］ 王鴻飛，莊榮玉.百可得對溫州柑橘的保鮮.寧波大學學報 ［J］，2000:13(1):88-91.

［3］ 吳珉，李振，胡秀卿，等.高效液相色譜法測定番茄與土壤中雙胍三辛烷苯基磺酸鹽殘留量［J］.農藥，2006，45(11):775-777.

［4］ 樊德方.農藥殘留分析與檢測［M］.上海:上海科學技術出版社，1982:116-139.

［5］ 農業部農藥檢定所.農藥殘留實用檢測方手冊 (一)［M］.北京:中國農業科技出版社，1995:7-35.