三氧化二砷對U2－OS人骨肉瘤細胞形態及細胞凋亡的影響

秦建英 張俊紅 陳清漢

1)河南平頂山市新華區人民醫院 平頂山 467000 2)河南中平能化集團總醫院 平頂山 467000 3)鄭州大學第二附屬醫院骨科 鄭州 450014

三氧化二砷對U2－OS人骨肉瘤細胞形態及細胞凋亡的影響

秦建英1)張俊紅2)陳清漢3)

1)河南平頂山市新華區人民醫院 平頂山 467000 2)河南中平能化集團總醫院 平頂山 467000 3)鄭州大學第二附屬醫院骨科 鄭州 450014

目的研究三氧化二砷在體外對人骨肉瘤細胞(U2－OS)形態及細胞凋亡的影響。方法以不同濃度三氧化二砷(0.5、1.0、1.5 μmol/L)作用骨肉瘤細胞，15mg/L 5－FU作為陽性對照，采用熒光顯微鏡觀察細胞核形態及流式細胞儀檢測細胞凋亡率。結果各濃度的三氧化二砷對骨肉瘤細胞(U2－OS)的形態均有影響，隨著三氧化二砷濃度的升高，細胞核發生固縮越明顯，細胞凋亡率越高，與正常對照組相比，差異具統計學意義。結論三氧化二砷可導致骨肉瘤細胞(U2－OS)細胞核發生固縮壞死和凋亡，凋亡率與三氧化二砷濃度有依賴關系，在一定濃度范圍內隨濃度增高而增高。

三氧化二砷;US－OS細胞系;骨肉瘤;細胞凋亡

骨肉瘤多發生于青少年的惡性間葉組織性腫瘤，破壞能力強，術后易復發。為探索三氧化二砷對人骨肉瘤細胞的作用，2010－10—2011－06，我們采用體外實驗方法，觀察不同濃度、不同時間三氧化二砷對人骨肉瘤U－20S細胞形態及凋亡的影響，為臨床人骨肉瘤的治療提供新的理論依據。

1 材料和方法

1.1 材料 三氧化二砷(鄭州創生生物公司)、DMEM培養基(美國Gibco公司)、胎牛血清(杭州四季青公司)、胰蛋白酶(美國Sigema公司)、青鏈霉素混懸液(美國Sigema公司)、細胞凋亡試劑盒(鄭州創生生物公司)、超凈工作臺(蘇州凈化設備廠)、全自動酶標儀(Thermo公司)、流式細胞儀(Benekman公司)、倒置熒光顯微鏡(日本Olympus公司)。

1.2 方法

1.2.1 藥物配制及分組設置:取0.019 g三氧化二砷溶于100mL蒸餾水中，充分混勻，配制成濃度為100 μmol/L母藥溶液，一次性濾器過濾后4℃保存備用，使用時加入培養基稀釋至終濃度。陰性對照組:加同體積培養液;陽性對照組:15mg/L 5－FU;藥物組:0.5、1.0、1，5μmol/L，

1.2.2 細胞免疫熒光染色:取對數生長期 U2－OS細胞，以0.25%胰蛋白酶制成1.0×10個/mL細胞懸液;取6孔板，每孔滴加1mL培養液，小心取出爬片貼于孔底;每孔滴加細胞懸液1mL;加培養液3mL，輕柔吹打混勻;置于培養箱孵育24 h后棄去舊培養液，分別加入低、中、高濃度三氧化二砷4mL，同時設陰性及陽性對照，如上。繼續培養24 h，棄去培養液，每孔加1mL PBS，清洗細胞正反面;多聚甲醛與培養液1:3混合液1mL固定細胞10min;去除對于多聚甲醛，Hochesths－333421mL，37℃避光染色10min;熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.3 流式細胞儀檢測細胞凋亡率:取對數生長期U2－OS細胞，以1.0×10個/mL的細胞濃度，接種于6孔板內，置于37℃，5%CO2培養箱中培養，24 h后換液，藥物組分別加入低、中、高濃度含氯化鋰培養液2mL，終濃度分別為40、80、150 mmol/L，陰性對照組加入等體不含藥培養液，陽性對照組加入等體積含15mg/L 5－FU培養液，繼續培養48 h后，收集細胞調整濃度為 1.0×106個/mL，1000 r/min，離心 5min，棄去培養液;加PBS 1mL清洗2次，離心，加入冰預冷的70%乙醇固定，4℃過夜;離心棄去固定液，加入PI染液1mL，于4℃避光染色30min，400目尼龍網過濾，用流式細胞儀檢測凋亡率。Cell Quest軟件進行數據分析。Annexin－V陽性(無論PI是否陽性)的細胞認為是凋亡細胞，而PI陽性且Annexin－V陰性的細胞認為是壞死細胞，計算細胞凋亡率。碘化丙啶(PI)是一種核酸染料，它不能透過完整的細胞膜，但在凋亡中晚期的細胞和死細胞，PI能夠透過細胞膜而將細胞核染紅。因此將Annexin－V與PI匹配使用，就可以將凋亡早晚期的細胞以及死細胞區分開來。

1.3 統計學方法 Cell Quest軟件進行數據分析。

2 結果

2.1 倒置熒光顯微鏡觀察細胞核形態變化 在倒置顯微鏡下觀察細胞形態，對照組U－20S細胞成簇生長，細胞大小基本一致，呈圓形或橢圓形，胞質透亮，折光性較弱(圖1)而經過三氧化二砷處理后。細胞形狀變圓，體積變小，胞質透亮度下降，許多細胞由瓶壁脫落并懸浮于培養液中，可見發泡現象并見到細胞碎片。上述改變隨三氧化二砷作用時間的延長和度的提高而更加明顯。中等濃度(1.0 μmol/L)三氧化二砷作用于U2－OS細胞24 h后，與對照組相比，細胞核出現固縮，染色加深，可見凋亡小體(圖2)。(1)細胞體積變小，全面皺縮。(2)凋亡小體為數個圓形小體圍繞在細胞周圍。

2.2 三氧化二砷對U2－OS細胞凋亡率的影響 不同濃度三氧化二砷作用U2－OS細胞48 h后，早期細胞凋亡率，對照組為 1.2% ，0.5 μmol/L 組為 23.6% ，1.0 μmol/L 組為 39.1% ，1.5 μmol/L組為51.0%，隨著藥物濃度增大，凋亡率也增大。表明三氧化二砷能使U2－OS細胞發生凋亡并呈濃度依賴性(圖3－6)。

3 討論

本研究結果顯示，三氧化二砷在一定濃度范圍(0.5～1.5 μmol/L)作用于U2－OS細胞，能使之出現較明顯的凋亡形態學改變。流式細胞儀檢測凋亡率與三氧化二砷處理時間、濃度呈正相關，提示三氧化二能有效地誘導U2－OS細胞凋亡。這些檢測證實三氧化二砷抑制U2－OS細胞的增殖主要是通過誘導細胞凋亡實現的，為臨床提供了理論依據。最近研究發現，As2O3可誘導骨肉瘤MG－63細胞凋亡［1］，誘導細胞凋亡和促進細胞分化作用與時間和劑量有關［2］。As2O3對U2－OS細胞增殖有明顯的抑制作用，能使U2－OS細胞阻滯于S期，有部分阻滯在G0/G1期［3］，且與As2O3藥物濃度關系密切，可能存在濃度范圍依賴性，有待進一步研究。研究表明As2O3的細胞毒作用有caspase依賴和非caspase依賴兩種途徑［4］。caspase－3在半胱氨酸家族中占重要地位，廣泛分布于組織中并參與不同細胞的凋亡［5］。As2O3通過破壞線粒體跨膜電位(△ψm)， 觸發了線粒體凋亡途徑，導致了caspase－3的活化，促使細胞凋亡［3］。我們將從細胞周期及增殖抑制率［6］進行研究已發表。

［1］宗建春，吳誠義.三氧化二砷作用機制的研究進展［J］.重慶醫學，2004，33(12):1880－1883.

［2］Munshin C，Tricot G，Desikan R，et al.Clinical aclivity of arsenic trioxide for the treatment of multiple myeloma［J］.Leukemia，2002，16(9):1835－1837.

［3］丁凡，邵增務，張保龍，等.維甲酸對人骨肉瘤細胞抑制增殖和誘導分化的影響［J］.臨床骨科雜志，2009，12(5):561－564.

［4］Obtsubo T，Kamada S，Mikami T，et al.Indentification of NRF，a member of the NF－F2 family of transcription factors.As a substrate for capase－3 protease cell［J］.Death Differ，1999，6:865－872.

［5］Jia P，Chen G，Huang X，et al.Arsenic troxide induces multiple myeloma cell opoptosis via disruption of mitochondrid transmembrane potentiao and actibvation of caspase－3［J］.Chin Med J(Engl)，2001，114:19－24.

［6］秦建英，陳清漢，趙意華.三氧化二砷對人骨肉瘤U2－OS細胞增殖和周期的影響［J］.山東醫藥，2011，47(51):47－48.

Effect of arsenic trioxide on U2－OS human osteosarcoma cell morphology and cell apoptosis

Qin Jianying，Zhang Junhong ，Chen Qinhan.Department of Orthoupatics，The Xinhua District People's Hospital of Pingdingshan City，Pingdingshan 467000，China

ObjectiveTo study the effect of arsenic trioxide on in vitro human osteosarcoma cells(U2－OS)morphology and cell apoptosis.Method with different concentrations of arsenic trioxide(0.5，1，1.5 mol/L)role of osteosarcoma cells，15mg/L 5－FU as positive control，using fluorescence microscopy observation of nuclear morphology and flow cytometric detection rate of apoptosis.Resultsthe concentration of arsenic trioxide on osteosarcoma cells(U2－OS)forms are affected，with elevated concentrations of arsenic trioxide，nuclear pyknosis and more obvious，apoptosis rate is high，compared with the normal group，the difference has statistical significance.Conclusionarsenic trioxide can cause osteosarcoma cells(U2－OS)nuclear pyknosis necrosis and apoptosis，apoptosis rate and arsenic trioxide concentration dependence，within certain range of concentration increased with the concentration.

Arsenic trioxide;US－OS cell line;Osteosarcoma;Cell apoptosis

R738

A

1007－8991(2012)04－0005－03

(收稿 2012－02－08)