RNAi沉默PRDXⅢ基因表達(dá)誘導(dǎo)U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)研究

左書浩 焦慶芳 焦保華

本文通過(guò)RNAi技術(shù)沉默人U251膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系中PRDXⅢ的表達(dá)，探討其對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡和生長(zhǎng)的影響，為膠質(zhì)瘤治療提供新的選擇。

1 材料與方法

1.1 材料 人腦膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞株購(gòu)自ATCC公司，RPMI-1640培養(yǎng)基購(gòu)自GIBCOBRL公司，RT-PCR二步法試劑盒購(gòu)自MBI公司，LipofectamineTM 2000購(gòu)自Invitrogen公司，Opti-MEM I Reduced Serum Medium購(gòu)自Invitrogen公司，凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自晶美公司，DNA Ladder試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所。PRDXⅢ引物1對(duì)，內(nèi)參照GAPDH引物1對(duì)，均由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。引物序列為:PRDXⅢ:上游引物:5’-CTTAAGAAGATGGCGGCTGCTGCTGTAGGAC-3’下游引物:5’-CTCGAGCATGGGTGATCTACTGATTTACCTT-3’GAPDH:上游引物:5’-ACCACATGCCCAGAGGGTCC-3’下游引物:5’-AGGAGGCTGGGCTGTCTGTA-3’基因特異干擾序列表達(dá)載體pGenesil-1-PRDXⅢ-1、pGenesil-1-PRDXⅢ-2、pGenesil-1-PRDXⅢ-3由中國(guó)武漢晶賽生物有限公司進(jìn)行設(shè)計(jì)與合成。

1.2 方法

1.2.1 U251細(xì)胞培養(yǎng)、傳代與保種:U251細(xì)胞用RPMI-1640培養(yǎng)液，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每2～3天換液1次，培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)至80%融合。加入新鮮的0.25%胰酶消化細(xì)胞，離心沉淀，然后分置細(xì)胞于新的培養(yǎng)瓶中，傳代比例為1∶3。最后按照每個(gè)凍存管2×106個(gè)細(xì)胞保種。細(xì)胞梯度冷凍，最后置于液氮罐中保存。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染:以0.25%胰酶消化收集細(xì)胞，轉(zhuǎn)種于6孔板，每孔1×105個(gè)細(xì)胞，加入2 ml含小牛血清和抗生素的培養(yǎng)基繼續(xù)孵育。當(dāng)細(xì)胞達(dá)到80%的融合時(shí)移去6孔板內(nèi)完全培養(yǎng)基，加入1 ml無(wú)血清無(wú)抗生素培養(yǎng)基，加入轉(zhuǎn)染復(fù)合物(含質(zhì)粒及脂質(zhì)體)，混勻，培養(yǎng)4～6 h后，換有血清有抗生素的完全培養(yǎng)基2 ml。轉(zhuǎn)染24 h后，熒光顯微鏡下觀察6孔板內(nèi)熒光以檢測(cè)基因轉(zhuǎn)染效率。以未轉(zhuǎn)染的空白對(duì)照組，空載體轉(zhuǎn)染組，無(wú)關(guān)序列轉(zhuǎn)染組為對(duì)照組。

1.2.3 PRDXⅢ的分離、擴(kuò)增:按照Trizol試劑說(shuō)明書步驟一步法提取總 RNA。合成 cDNA，通過(guò) RT-PCR法擴(kuò)增 PRDXⅢ(95℃預(yù)變性 3 min，95℃變性 30 s，61.4℃退火 35 s，72℃延伸1 min，共33個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10 min)和內(nèi)參基因GAPDH(95℃預(yù)變性 5 min 后，95℃變性45 s，56℃退火40 s，72℃延伸40 s，共35個(gè)循環(huán)后，72℃延伸10 min終止反應(yīng))，篩選有效的基因特異干擾序列。

1.2.4 Western blot檢測(cè)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中PRDXⅢ蛋白的表達(dá):轉(zhuǎn)染后48 h，以含0.25%胰蛋白酶消化收集細(xì)胞(細(xì)胞經(jīng)預(yù)冷的PBS漂洗3次);加入450 μl RIPA裂解液裂解細(xì)胞(冰上操作)，在振蕩器上混勻4～15 min，14 000 g離心15 min(4℃)，棄沉淀;處理后的樣品加入樣品緩沖液，煮沸5 min，12 000 g離心5 min，取上清液，用分光光度計(jì)對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行定量檢測(cè)。將蛋白樣本進(jìn)行凝膠電泳，然后電轉(zhuǎn)移至PVDF膜。TBS洗膜3次后裝入密封袋，加入1∶4 000稀釋的一抗，4°C過(guò)夜，緩慢搖動(dòng)。棄一抗，TBS/T緩沖液室溫潤(rùn)洗，5 min×4次。裝入新的密封袋，加入1∶5 000稀釋的的二抗，室溫孵育1 h，緩慢搖動(dòng)。棄二抗，TBS/T緩沖液室溫潤(rùn)洗，10 min×3次，浸泡于TBS中待檢測(cè)。加入DAB顯色液，顯色5 min。以β-actin為內(nèi)參，其一抗稀釋度為1∶3 000。在凝膠成像系統(tǒng)上分析處理蛋白條帶，拍照。以PRDXⅢ蛋白條帶OD值與內(nèi)參照OD值的比值來(lái)表示蛋白表達(dá)的量。

1.2.5 DNA Ladder:每 106個(gè)細(xì)胞中加入 500 μl添加了蛋白酶K的樣品裂解液，Vortex混勻，充分裂解細(xì)胞，50℃水浴消化過(guò)夜。加入500 μl Tris平衡苯酚，劇烈震蕩10～30 s，以使酚相和水相充分相互作用以抽提樣品。吸出約300 μl上清液，加入60 μl 10 mol/L醋酸銨和600 μl無(wú)水乙醇，顛倒數(shù)次混勻，此時(shí)可見(jiàn)DNA沉淀產(chǎn)生，－20℃凍存1 h，以充分沉淀小片斷DNA。12 000 g離心10 min，棄上清，加入70%乙醇洗滌 DNA沉淀1次。盡量吸除殘余的乙醇，加入50～100 μl TE溶解DNA，取部分抽提得到的基因組DNA，瓊脂糖凝膠電泳分析。

1.2.6 PI染色:轉(zhuǎn)染后48 h PI染色觀察細(xì)胞凋亡。將蓋玻片取出，滴上1滴PI液，熒光顯微鏡下觀察紅色熒光。實(shí)驗(yàn)分組同上:干擾質(zhì)粒實(shí)驗(yàn)組，無(wú)關(guān)序列對(duì)照組，空白載體對(duì)照組及未處理的空白對(duì)照組。

1.2.7 流式細(xì)胞儀(FCM)檢測(cè)細(xì)胞凋亡:轉(zhuǎn)染后48 h收集細(xì)胞約5 ×106個(gè)，離心，1 000 r/min，5 min，棄去培養(yǎng)液;PBS洗滌2次;離心，1 000 r/min，5 min，去上清液;加入冰預(yù)冷的70%的乙醇固定，4℃，1 ～2 h;離心，1 000 r/min，5 min，棄去固定液;PBS重懸細(xì)胞，400目的篩網(wǎng)過(guò)濾1次，1 000 r/min，離心5 min，棄去PBS;用1 ml PI染液染色，4℃避光30 min;流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.2.8 MTT比色分析轉(zhuǎn)染后細(xì)胞增殖活性:將U251細(xì)胞接種到96孔板，每孔2×103細(xì)胞，待細(xì)胞達(dá)80%融合后，選擇基因特異干擾序列3由脂質(zhì)體包裹進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后48 h，每孔加入10 ～15 μl MTT(5mg/ml)，5%CO2培養(yǎng)箱中孵育4 h，將孔內(nèi)液體全部吸去，每孔加入100 μl DMSO，10 min后用酶標(biāo)儀在490 nm波長(zhǎng)處讀取吸收值。計(jì)算干擾后對(duì)細(xì)胞的生存抑制率。以空白組、空載體轉(zhuǎn)染組和無(wú)關(guān)序列轉(zhuǎn)染組作對(duì)照。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以±s表示，采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RT-PCR分析轉(zhuǎn)染后PRDXⅢmRNA水平變化 半定量RT-PCR檢測(cè)示，空載體組和無(wú)關(guān)序列組PRDXⅢmRNA表達(dá)無(wú)明顯變化，干擾序列1、3使PRDXⅢmRNA的表達(dá)明顯降低，尤以干擾序列3的效果最顯著，對(duì)PRDXⅢmRNA的表達(dá)抑制率為76%。見(jiàn)表1、圖1。

表1 干擾后4組PRDXⅢmRNA表達(dá)水平的變化±s

表1 干擾后4組PRDXⅢmRNA表達(dá)水平的變化±s

注:與空白對(duì)照比較，*P ＜0.05

類別 PRDXⅢ/GAPDH 抑制率(%) P值0.84 ±0.025 0.00干擾序列1 0.26 ±0.024* 69干擾序列2 0.68 ±0.020 19干擾序列3 0.20 ±0.047*空白對(duì)照76

2.2 Western Blotting分析轉(zhuǎn)染后PRDXⅢ蛋白表達(dá)變化Western Blotting結(jié)果顯示，空載體組和無(wú)關(guān)序列組PRDXⅢ蛋白表達(dá)無(wú)明顯變化，干擾序列1、3對(duì)PRDXⅢ蛋白表達(dá)有明顯抑制作用，以干擾序列3作用最顯著，抑制率達(dá)到63.9%。見(jiàn)表 2、圖 2。

圖1 PRDXⅢ基因有效特異干擾序列篩選分析

表2 干擾后各組PRDXⅢ蛋白表達(dá)水平±s

表2 干擾后各組PRDXⅢ蛋白表達(dá)水平±s

注:與空白對(duì)照比較，*P ＜0.05

類別 PRDXⅢ/β-actin 抑制率(%) P值0.72 ±0.015 0.00干擾序列1 0.33 ±0.020* 54.2干擾序列2 0.56 ±0.026 22.2干擾序列3 0.26 ±0.020*空白對(duì)照63.9

圖2 Western Blotting檢測(cè)干擾后PRDXⅢ蛋白表達(dá)

2.3 DNA ladder 細(xì)胞凋亡時(shí)主要的生化特征是其染色質(zhì)發(fā)生濃縮，染色質(zhì)DNA在核小體單位之間的連接處斷裂，形成180-200bp整數(shù)倍的寡核苷酸片段，在凝膠電泳上表現(xiàn)為梯形電泳圖譜(DNA ladder)。試驗(yàn)結(jié)果顯示干擾組出現(xiàn)明顯梯形電泳條帶，說(shuō)明有較明顯的細(xì)胞凋亡，而空白對(duì)照組，空載體和無(wú)關(guān)序列組未見(jiàn)梯形電泳條帶。見(jiàn)圖3。

圖3 DNA ladder顯示干擾組DNA梯形電泳條帶

2.4 PI染色 空白對(duì)照組，空脂質(zhì)體組和空載體組細(xì)胞未見(jiàn)明顯凋亡;而干擾組細(xì)胞染色質(zhì)出現(xiàn)濃縮狀態(tài)，細(xì)胞核的染色質(zhì)高度凝聚，部分細(xì)胞核裂解為碎塊，產(chǎn)生凋亡小體，符合凋亡的形態(tài)學(xué)改變。見(jiàn)圖4。

2.5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡 流式細(xì)胞儀檢測(cè)顯示空白對(duì)照組、空載體組、無(wú)關(guān)序列組和干擾組細(xì)胞凋亡率分別為(2.3±0.6)%、(2.7 ±0.7)%、(3.5 ±0.6)%和(35.9 ±4.8)%，干擾組細(xì)胞調(diào)亡率明顯高于空白對(duì)照組、空載體組、無(wú)關(guān)序列組(F=219.76，P ＜0.01)，而空白對(duì)照、空載體組和無(wú)關(guān)序列組之間促凋亡率的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見(jiàn)圖5。

圖4 PI染色

圖5 FCM檢測(cè)干擾后48 hU251細(xì)胞凋亡率

2.6 MTT檢測(cè)RNAi后U251細(xì)胞生長(zhǎng)活性 MTT比色實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示空白對(duì)照組、空載體組、無(wú)關(guān)序列組和干擾組轉(zhuǎn)染后48小時(shí)的光吸收值分別為(1.26 ±0.06)、(1.22 ±0.09)、(1.19 ±0.02)和(0.70 ±0.07)，干擾組光吸收值明顯低于空白對(duì)照組、空載體組和無(wú)關(guān)序列組，而空白對(duì)照組、空載體組和無(wú)關(guān)序列組相互間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。干擾組對(duì)U251細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制率為44.4%，明顯減慢了細(xì)胞生長(zhǎng)(F=49.9，P ＜0.01)。

3 討論

RNA 干擾(RNA interference，RNAi)［1］是雙鏈 RNA(double－stranded RNA，dsRNA)介導(dǎo)的特異性基因表達(dá)沉默現(xiàn)象，是指當(dāng)細(xì)胞中導(dǎo)入與內(nèi)源性mRNA編碼區(qū)同源的dsRNAs時(shí)，該mRNA發(fā)生降解而導(dǎo)致基因表達(dá)沉默的現(xiàn)象。由于這種現(xiàn)象發(fā)生在轉(zhuǎn)錄后水平，故又稱為轉(zhuǎn)錄后基因沉默(post transcriptional gene silencing，PTGS)。

RNAi包含至少下列幾個(gè)連續(xù)的步驟［2］:(1)外源性或內(nèi)源性的dsRNA在細(xì)胞內(nèi)與一種RNA酶Ⅲ(RNAⅢendonucleasedicer)結(jié)合，隨即被切割成含有3’端單鏈尾巴及磷酸化的5’端的21-23nt的短鏈 dsRNA，是 RNAi的起始誘導(dǎo)物，即 siRNA［3］。(2)siRNA與相關(guān)蛋白形成RNA引導(dǎo)的沉默復(fù)合體(RNA induced silencing complex，RISC)［4］，RISC 具有核酸酶活性，它可以在siRNA的引導(dǎo)下特異降解相應(yīng)的mRNA。(3)siRNA按照堿基互補(bǔ)原則識(shí)別靶基因轉(zhuǎn)錄出的mRNA，并引導(dǎo)RICS復(fù)合體結(jié)合mRNA。(4)siRNA與mRNA在復(fù)合體中換位，核酸酶Dicer將mRNA切割成21-23nt的片斷，特異性地抑制靶基因地表達(dá)。而新形成的dsRNA可再次形成RISC復(fù)合體，繼續(xù)降解mRNA，從而產(chǎn)生級(jí)聯(lián)放大效應(yīng)。因此，每個(gè)細(xì)胞僅需要幾個(gè)siRNA就能引起強(qiáng)烈的RNAi反應(yīng)。siRNA還可以在RNA依賴性RNA聚合酶(RNA dependent RNA polymerase，RdRp)的作用下大量擴(kuò)增，并轉(zhuǎn)運(yùn)出細(xì)胞，使RNA擴(kuò)散到整個(gè)機(jī)體并可以傳代［5］。最近的研究也有顯示，RNAi不僅在轉(zhuǎn)錄后水平發(fā)揮作用，而且在轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平也有一定程度的抑制特異基因表達(dá)的作用。針對(duì)靶基因設(shè)計(jì)出特異性的具有高效抑制作用的siRNA序列是RNAi成功的關(guān)鍵。在siRNA序列的選擇上應(yīng)注意:(1)siRNA序列的長(zhǎng)度。序列太短則不足以誘導(dǎo)特異性的基因抑制，太長(zhǎng)又會(huì)激活哺乳動(dòng)物細(xì)胞的抗病毒防御機(jī)制。21nt的siRNA既可在哺乳動(dòng)物細(xì)胞介導(dǎo)基因特異性的抑制作用，又不會(huì)引起宿主細(xì)胞非特異性的抗病毒反應(yīng)，所以目前多數(shù)的siRNA是21nt的雙鏈。另外，在3’對(duì)稱懸掛2nt的堿基(通常為UU)的siRNA降解靶基因mRNA最為有效［6］，尤其是在反義鏈3’懸掛2ntUU對(duì)誘導(dǎo)哺乳動(dòng)物細(xì)胞中有效的RNAi尤為重要［7］。(2)靶序列的選擇。在目標(biāo)分子的作用部位選擇上，一般認(rèn)為在cDNA的轉(zhuǎn)錄起始位置下游50～100 bp處較好，要避開(kāi)轉(zhuǎn)錄的非翻譯區(qū)。在靶基因的成熟 mRNA序列AUG起始密碼子后尋找到以“AA”開(kāi)頭的序列，再向下游取19nt作為正義序列。(3)干擾分子的GC含量一般在30% ～70%，最好50%左右。我們按照上述原則設(shè)計(jì)了3條siRNA序列，利用真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染U251細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后24和48 h分別以RT-PCR和Westtern blotting檢測(cè)PRDXⅢmRNA和蛋白的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)第1、3條siRNA序列較好地抑制了PRDXⅢmRNA和蛋白的表達(dá)，尤以第3條最佳，對(duì)PRDXⅢmRNA和蛋白表達(dá)的抑制率分別達(dá)到76%和63.9%。在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中我們利用第3條干擾序列進(jìn)行進(jìn)一步的凋亡研究。PRDXⅢ與細(xì)胞凋亡有關(guān)，PRDXⅢ過(guò)表達(dá)可以抑制藥物誘導(dǎo)的凋亡，而降低PRDXⅢ表達(dá)使得細(xì)胞對(duì)凋亡更加敏感［8，9］。我們利用RNAi技術(shù)成功地抑制了U251細(xì)胞中PRDXⅢ基因和蛋白的表達(dá)，轉(zhuǎn)染后48 h流式細(xì)胞儀檢測(cè)，干擾組細(xì)胞凋亡率明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;DNA ladder顯示干擾組有凋亡典型的梯形條帶，而各對(duì)照組未見(jiàn)此現(xiàn)象;PI染色顯示干擾組細(xì)胞染色質(zhì)出現(xiàn)濃縮狀態(tài)，細(xì)胞核的染色質(zhì)高度濃染，部分細(xì)胞核裂解為碎塊，符合凋亡的形態(tài)學(xué)改變;MTT顯示干擾組對(duì)U251細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制率為44.4%，明顯減慢了細(xì)胞生長(zhǎng)，而無(wú)關(guān)序列組、空載體組和空白對(duì)照組之間細(xì)胞生長(zhǎng)無(wú)明顯差異。這些結(jié)果表明，PRDXⅢ基因在膠質(zhì)瘤中高表達(dá)可以抑制腫瘤細(xì)胞凋亡，從而使其增殖加快，而抑制PRDXⅢ基因表達(dá)能夠誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤凋亡，減緩腫瘤生長(zhǎng)，因此，PRDXⅢ基因有可能成為膠質(zhì)瘤基因治療的靶基因，為膠質(zhì)瘤治療提供了一個(gè)新的選擇。

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