基因芯片技術(shù)檢測結(jié)核分枝桿菌對(duì)利福平和異煙肼耐藥性的研究

康麗菲 朱桂云 李秀武 許志明 李曉霞 安曉穎 劉娜

目前，用于結(jié)核分枝桿菌耐藥性的檢測方法主要以培養(yǎng)為基礎(chǔ)的絕對(duì)濃度法或比例法，需要2～3個(gè)月才能得到結(jié)果，延誤了患者及時(shí)準(zhǔn)確用藥，因此不能完全滿足臨床需要。創(chuàng)建快速、簡便、準(zhǔn)確的檢測方法對(duì)臨床治療有積極意義。基因芯片技術(shù)正是為了滿足這種需求，用于結(jié)核分枝桿菌耐藥性檢測，對(duì)輔助用藥有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料 收集我院臨床診斷結(jié)核病標(biāo)本21例，包括痰13例，肺泡灌洗液6例，傷口分泌物2例。均經(jīng)過培養(yǎng)得到分離菌液。

1.2 儀器與試劑 ExtractorTM36核酸提取儀，Hybset基因微陣列芯片雜交盒BioMixerTMII，PCR擴(kuò)增儀TC-25/H，離心機(jī)和離心干燥芯片的容器SliderWasherTM8，微陣列芯片掃描儀Lux-Scan 10K-B，基因芯片(利福平檢測rpoB基因，異煙肼檢測katG和inhA基因)及洗液SSC和SDS，核酸提取液，PCR擴(kuò)增試劑1、2、3，雜交緩沖液，均購自北京博奧生物有限公司。

1.3 方法 痰及肺泡灌洗液樣本處理:向盛有痰樣的無菌盒中加入1～2倍4%NaOH，震蕩混勻，15～20 min后加入pH值6.8磷酸緩沖液混勻，離心后去上清，沉淀再加入0.5～1 ml磷酸緩沖液混勻，接種，培養(yǎng)。分泌物樣本處理:加入1～3倍體積4%H2SO4，混勻，靜置20～25 min，接種，培養(yǎng)。所有標(biāo)本進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)后，一部分繼續(xù)做藥敏試驗(yàn)檢測，一部分直接做基因芯片檢測。培養(yǎng)后基因芯片技術(shù)檢測的過程:培養(yǎng)后，吸取≥1個(gè)麥?zhǔn)蠞岫鹊木鷳乙?0～20 μl，于含核酸提取液的核酸提取管中，使用核酸提取儀快速震蕩5 min，95℃水浴5 min，5 000 r/min離心1 min，得到的核酸擴(kuò)增，每個(gè)樣品進(jìn)行3管PCR反應(yīng)，將 PCR 擴(kuò)增試劑 1、2、3 分別按 18 μl/管分裝于200 μl離心管或八連管中，再加入模板DNA各2 μl于3管中，進(jìn)行擴(kuò)增(擴(kuò)增程序37℃ 10 min 1個(gè)循環(huán)，94℃ 10 min 1個(gè)循環(huán)，94℃ 15 s→ 60℃ 30 s →72℃ 40 s，45 個(gè)循環(huán)，94℃30 s→72℃60 s，10個(gè)循環(huán)，72℃ 7 min 1個(gè)循環(huán)，4℃ 1個(gè)循環(huán))，(PCR產(chǎn)物1為對(duì)照產(chǎn)物，PCR產(chǎn)物2為rpoB基因的擴(kuò)增產(chǎn)物，與利福平微陣列相對(duì)應(yīng)，PCR產(chǎn)物3為KatG基因及inhA基因啟動(dòng)子的擴(kuò)增產(chǎn)物，與異煙肼微陣列相對(duì)應(yīng))。

將雜交緩沖液9 μl/管，分裝于2管中，將PCR產(chǎn)物1和2各3 μl放于雜交緩沖液的管中(雜交反應(yīng)混合物R檢測利福平)，PCR產(chǎn)物1和PCR產(chǎn)物3各3 μl放于雜交緩沖液的另一管中(雜交反應(yīng)混合物H檢測異煙肼)，將雜交反應(yīng)混合物加熱至95℃，再變性5 min后立即放于冰水混合物中3 min。提前向雜交盒中加入200 μl的蒸餾水，放好芯片及蓋片預(yù)熱50℃。將雜交反應(yīng)混合物從冰浴中取出，經(jīng)雜交盒蓋片的加樣孔加入13.5 μl雜交反應(yīng)物，微陣列1和3加入雜交反應(yīng)混合物R，微陣列2和4加入雜交反應(yīng)混合物H，立即把密封好的雜交盒放入雜交儀中50℃，120 min，再進(jìn)行芯片洗滌(洗液Ⅰ:依次將20*SSC、蒸餾水、10%SDS，按照 10∶88∶2的比例混合，洗液Ⅱ:將20*SSC、蒸餾水按1∶99的比例混合，洗液Ⅰ清洗1次，30℃，120 s，洗液Ⅱ清洗2次，30℃，60 s)與甩干，最后上機(jī)掃描。

2 結(jié)果

2.1 利福平耐藥檢測 21例中，利福平rpoB基因10例突變型(圖1)，10例野生型(圖 2)，1例無法判讀?？偼蛔兟?7.6%，其中9例為531位點(diǎn)的(C-T)突變，1例526位點(diǎn)的(CG)突變。與藥敏實(shí)驗(yàn)的符合率為81.0%。利福平的11例耐藥株中，基因芯片檢測8例為突變型，突變率72.7%，在利福平的10例敏感株中，基因芯片檢測2例為突變型，突變率20.0%。

2.2 異煙肼耐藥檢測 21例中，異煙肼基因有6例突變型，15例野生型(圖3)，總突變率28.6%，其中4例為KatG 315(G-C)突變(圖4)，占 66.7%，2例為 inhA-15(C-T)突變(圖 5)，占33.3%。與藥敏實(shí)驗(yàn)的符合率為90.5%。在異煙肼的6例耐藥株中，基因芯片檢測5例為突變型，突變率83.3%，在異煙肼的15例敏感株中，基因芯片檢測1例為突變型，突變率6.7%。

圖1 利福平ropB突變

圖2 利福平野生型

圖3 異煙肼野生型

圖4 異煙肼katG突變

圖5 異煙肼inhA突變

3 討論

結(jié)核病的臨床診療中，利福平和異煙肼是抗結(jié)核的一線藥物，但近幾年隨著結(jié)核病的發(fā)展，結(jié)核分支桿菌對(duì)藥物的抗藥性逐漸增強(qiáng)。結(jié)核分支桿菌的耐藥性是由相關(guān)基因突變引起的。因此一線藥物的耐藥性檢測對(duì)于臨床治療結(jié)核病有積極意義。傳統(tǒng)藥敏實(shí)驗(yàn)檢測結(jié)核耐藥有一定的缺陷，如耐藥性的界限不統(tǒng)一，時(shí)間較長，結(jié)核菌培養(yǎng)期間可能發(fā)生基因突變等。難以滿足真正快速檢測的需要。基因芯片技術(shù)能快速準(zhǔn)確的檢測結(jié)核桿菌耐藥性，將檢測時(shí)間2～3個(gè)月縮短到2 d。

基因芯片是指將大量不同的生物信息分子(如寡核苷酸、DNA或cDNA探針等)以高度密集的方式，有序地固定在固相支持物(玻璃片)上形成微陣列。當(dāng)熒光標(biāo)記的靶分子與芯片上的探針分子結(jié)合后，用激光共聚焦熒光掃描對(duì)熒光信號(hào)的強(qiáng)度進(jìn)行檢測，從而對(duì)雜交結(jié)果進(jìn)行量化分析。

結(jié)核分枝桿菌利福平耐藥主要是由于其作用靶分子RNA多聚酶β亞單位的編碼基因rpoB突變所致，且突變一般發(fā)生在507位至533位27個(gè)氨基酸密碼子組成的區(qū)域內(nèi)［1］。其作用機(jī)制是通過與結(jié)核分枝桿菌RNA聚合酶的β亞單位結(jié)合，干擾轉(zhuǎn)錄的開始和RNA的延伸。其中最常見的突變位點(diǎn)是531位絲氨酸和526位組氨酸［2］，并且531位點(diǎn)突變＞526位點(diǎn)位點(diǎn)［3］。本實(shí)驗(yàn)中利福平的檢測基因?yàn)閞poB，21例樣本中有10例突變，總突變率為47.6%，與藥敏實(shí)驗(yàn)的符合率為81.0%，低于何敏等［4］的研究結(jié)果，其符合率為94.29%。其中531位點(diǎn)突變占90.0%，526位點(diǎn)突變占10%，531位點(diǎn)突變明顯高于526位點(diǎn)。11例利福平耐藥株中突變率為72.7%，10例利福平敏感株中突變率為20.0%，而崔振鈴等［5］研究發(fā)現(xiàn)94株利福平耐藥株中突變率為81.9%，46株利福平敏感株中突變率為13.0%。1例無法判讀，可能存在利福平新的突變位點(diǎn)。

結(jié)核分枝桿菌異煙肼耐藥與過氧化氫酶-過氧化物酶的編碼基因katG及烯?；€原酶編碼基因 inhA和 ahpC(羥基過氧化氫還原酶)基因的啟動(dòng)子的缺失或突變有關(guān)，其中 katG完全缺失或點(diǎn)突變是最主要的耐藥機(jī)制，最常見的突變位點(diǎn)是315 位 Ser［6］。

本實(shí)驗(yàn)中檢測異煙肼基因突變位點(diǎn)KatG 315和inhA-15，21例樣本中總突變率為28.6%，而低于謝士達(dá)等［7］的研究結(jié)果，其異煙肼耐藥總突變率為35.5%。本實(shí)驗(yàn)中KatG 315突變占66.7%，稍高于與謝士達(dá)的結(jié)果(62.5%)。大致驗(yàn)證了異煙肼耐藥主要是KatG突變。本實(shí)驗(yàn)中基因芯片與藥敏實(shí)驗(yàn)的異煙肼符合率為90.5%。

總之，用基因芯片檢測結(jié)核分枝桿菌耐利福平和異煙肼的基因突變，快速，準(zhǔn)確，敏感性高，特異性強(qiáng)。對(duì)臨床及時(shí)準(zhǔn)確進(jìn)行抗結(jié)核治療具有重要的臨床意義。

1 Garcia de Viedma D，del Sol Diaz Infantes M，Lasala F，et al.New realtime PCR able to detect in a single tube multiple rifampin resistance mutations and highlevel isoniazid resistance mutations in Mycobacterium tuberculosis.J Clin Microbiol，2002，40:988-995.

2 黃海榮，金奇，陳曦，等.中國結(jié)核分枝桿菌rpoB基因突變特點(diǎn).中華結(jié)核和呼吸雜志，2001，24:231-235.

3 丁金風(fēng)，楊渝珍，張先恩主編.基因分析核生物芯片技術(shù).第1版.武漢:湖北科學(xué)技術(shù)出版社，2004.294.

4 何敏，曾爾良，鄭艷燕，等.利用基因芯片檢測結(jié)核分枝桿菌及其利福平耐藥性的研究.中華流行病學(xué)雜志，2003，24:385-388.

5 崔振鈴，景奉香，胡忠義，等.基因芯片檢測結(jié)核分枝桿菌利福平和異煙肼耐藥性研究.中華結(jié)核和呼吸雜志，2004，27:439-441.

6 李桂蓮，王擷秀，趙德福.結(jié)核分枝桿菌耐藥基因的研究進(jìn)展.中國慢性病預(yù)防與控制，2006，14:377-379.

7 謝士達(dá)，劉永成，張鳳池，等.基因芯片技術(shù)快速檢測結(jié)核分支桿菌異煙肼、利福平耐藥性.臨床肺科雜志，2008，13:147-149.