自體外周血單個核細胞移植對下肢動脈硬化閉塞癥的治療

王晶瑩 羅玉賢 王兆娜 田惠 胡雅萍 王志波 謝紹建

嚴重下肢動脈硬化閉塞癥的治療一直是世界性的難題。治療性血管生成是近年來發展的一項新技術。外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMNCs)中存在能分化為血管內皮細胞的前體細胞-血管內皮祖細胞(endothelia progenitor cell，EPC)，且可分泌多種血管生成因子。因此我們設計了經血管腔內途徑移植全部自體PBMNCs治療下肢缺血性疾病的臨床研究。

1 資料與方法

1.1 一般資料 本院2004年12月至2008年6月期間收治的晚期下肢動脈硬化閉塞癥患者125例，均有有不同程度肢冷、間歇性跛行及下肢潰瘍，為中、重度以上下肢缺血。均經數字減影血管造影(DSA)證實，動脈狹窄或閉塞部位以腘動脈遠端為重且遠端無流出道。經正規袪聚、降糖、降脂及擴血管藥物治療無效，癥狀進行性加重，瀕臨截肢。

1.2 方法

1.2.1 單個核細胞動員及分離:予G-CSF(金磊賽強，長春金磊藥業公司)300 μg肌內注射，2次/d，連用 3 d，第 3天用AS104血細胞分離機(Fresenius Medical Care，Japan)單獨采集和分離單個核細胞，配制成50 ml的細胞混懸液供移植用。

1.2.2 經皮球囊擴張成形術:于第3天在導管室應用3×120 mm Amphirion Deep球囊(Invatec，Italy)擴張狹窄動脈，同時將分離的PBMNCs通過鞘管動脈腔內注入(圖1)。

1.2.3 并發癥防治:動員過程中為避免因白細胞增多或高凝狀態導致急性心腦血管意外，用低分子肝素(海普寧，江蘇江山制藥)5 000 U皮下注射，2次/d，共5 d。細胞注射后，為預防感染，用頭孢呋辛鈉2.0 g加入0.9%氯化鈉溶液100 ml中靜脈滴注，2 次/d，共3 d。

1.2.4 觀察指標:觀察肢冷、間歇性跛行或靜息痛及下肢潰瘍愈合情況，測量跛行距離及踝肱指數。

1.3 隨訪 所有患者均于移植后1、6及12個月隨訪。觀察肢冷、間歇性跛行或靜息痛及下肢潰瘍愈合情況，測量跛行距離及踝肱指數，磁共振血管成像(MRA)作為影像學隨訪，所有患者均拒絕行DSA檢查。

1.4 統計學分析應用SPSS 11.5統計軟件，計量資料以±s表示，采用t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 癥狀與體征 PBMNCs移植后3 d，患肢冷感即有不同程度改善，至6個月隨訪未見惡化。跛行距離入院時為(24±14.75)m，1 個月時提高到(139 ±52.73)m(P=0.008)，6 個月時提高到(406±155.34)m(P=0.006)，12 個月時為(642 ±224.10)m(P=0.004)。見表1。潰瘍于移植后明顯好轉，1～3個月逐漸愈合(圖2)。

2.2 踝肱指數測定 入院時為0.60±0.07，PBMNCs移植后1 個月提高到 0.84 ±0.11(P=0.009)，6 個月時略有下降，為0.78 ±0.08(P=0.009)，12 個月時繼續下降，為 0.70 ±0.07(P=0.034)，但仍略高于入院時的水平。見表1。

2.3 MRA檢查 PBMNCs移植前與6個月隨訪時顯示脛前、脛后或腓動脈狹窄或閉塞不同程度改善(圖3)。

2.4 并發癥與不良反應 PBMNCs移植前后未出現任何并發癥和不良反應。

3 討論

近年來，下肢動脈硬化閉塞癥所致下肢缺血性疾病明顯增多，相當一部分患者將發展為肢體壞疽，最終導致截肢。以往主要采用藥物、血管腔內介入及手術搭橋治療，但疾病往往慢性進展，尤其對腘動脈遠端小動脈及遠端流出道差的患者，目前尚無有效的治療方法。

表1 PBMNCs移植前后跛行距離和踝肱指數變化情況 n=125，xˉ±s

圖1 經皮球囊擴張成形術前DSA示脛后動脈起始部以遠長段閉塞

圖2 術中3×120 mm Deep球囊擴張成 形，PBMNCs腔內注射

圖3 術后DSA示脛后動脈通暢，成形良好，并可見側枝開放

治療性血管生成是由Hockel等于1993年首先提出。1997年Asahara等［1］首次證明出生后外周血中存在EPC，EPC主要存在于骨髓，少量存在于外周血中。實驗證實EPC不僅參與胚胎血管生成，而且也參與出生后的血管發生過程。因而近年來出現通過補充EPC來治療缺血性疾病的血管新生療法，并取得了一定效果［2］。但骨髓采集需全身麻醉而且采髓量較大，對患者的全身情況要求高，部分患者心理上難以接受。PBMNCs中存在EPC，G-CSF能將骨髓中的EPC動員到外周血循環。最近研究表明骨髓干細胞移植后可促進VEGF和bFGF等血管生成因子的分泌，揭示了細胞因子移植比細胞移植可能有更好的療效［3］。因為骨髓源性及一些非骨髓源性的單個核細胞也具有內皮細胞分化的潛能且均可分泌這些細胞因子，因此我們設計并采用了移植G-CSF動員后全部自體PBMNCs治療下肢缺血性疾病的方法，這也許比單獨種植EPC有更好的療效，雖然目前尚無對照實驗。

本組125例患者移植后通過12個月觀察，患肢冷感、間歇性跛行或靜息痛等臨床癥狀不同程度好轉，潰瘍逐漸愈合，踝肱指數短期明顯提升。有報道G-CSF動員可出現白細胞增多或高凝狀態而有可能誘發急性心腦血管意外，我們在動員過程中同時使用低分子肝素，患者未出現這些并發癥。患者移植后也未出現任何移植相關并發癥和不良反應，初步結果表明我們設計的治療方案是安全、有效的，PBMNCs移植能一定程度改善PAD患者下肢的血液供應。其可能的療效機制包括在移植局部提供EPC和移植細胞在局部釋放多種血管生成因子，從而直接或間接地促進內皮細胞增生、遷移，在阻塞動脈遠端形成新的血管，通過“分子搭橋”為缺血組織增加血供。Kalka等［4］研究發現肢體缺血的治療應重視EPC在缺血組織的歸巢和在原位分化，我們采用經血管腔內途徑直接注入PBMNCs至缺血部位的方法，一方面可解決此問題，另一方面通過增加缺血組織的局部血供來促進潰瘍愈合。

采用PBMNCs移植的優點在于收集數量比先前報道的骨髓來源的多［5］，而且可方便的反復連續進行，盡管目前最佳移植數量仍不清楚。通過隨訪發現:ABI幾乎于12個月后恢復至診療前的水平，但跛行距離卻顯示持續好轉，這說明ABI可能并不能真實反映外周循環改善程度。目前仍無評價移植后血管再生程度的客觀及可靠指標。

膝下血管擴張成形術能夠促進足部血運重建及側枝循環建立，降低截肢平面，并可重復操作，并發癥少。雖然再狹窄率仍很高，但因其是一個漸進的過程，且可以迅速改善肢體血供，為患足潰瘍愈合贏得了時間，隨著再狹窄的形成，肢體側枝循環亦隨之代償建立［6］。在此基礎上聯合PBMNCs移植，對側枝循環建立與開放有很大的促進及放大作用。這也是采用血管腔內途徑治療的優勢所在。

跛行距離是患者從開始行走到出現疼痛時的行程，是下肢缺血的主要臨床表現，具有一定主觀性。ABI是踝動脈壓與肱動脈壓的比值，作為一項無創檢查，被廣泛用來評價下肢動脈缺血程度，但由于ABI反映的是下肢主干動脈的血液灌注情況，對側枝循環改善程度反映不敏感，所以并不能真實反映外周循環綜合改善程度。兩項指標的結合，可以從主觀和客觀兩個角度更好的綜合評價PBMNCs移植的效果。通過12個月隨訪發現:移植后患者跛行距離持續延長，而ABI短期提升明顯，但此后逐漸下降，說明血管腔內成形術在治療初期對下肢主干動脈缺血改善作用明顯，隨著時間延長，主干動脈會發生不同程度再狹窄，而PBMNCs的“分子搭橋”作用則日益凸顯，通過新生側枝循環建立為缺血部位供血，表現在臨床上就是跛行距離持續延長，這也是PBMNCs移植的價值所在。目前仍無評價移植后血管再生程度的客觀及可靠指標。采用PBMNCs移植的優點在于收集數量比先前報道的骨髓來源的多，而且可方便的反復連續進行。

總之，采用動員后的PBMNCs經血管腔內途徑移植治療下肢動脈硬化閉塞癥，具有微創、安全、并發癥少、可重復等優點，值得進一步深入研究。

1 Asahara T，Murohara T，Sullivan A，et al.Isolation of putative progenitor endothelial cells for angiogenesis.Science，1997，275:964-967.

2 Gallagher KA，Goldstein LJ，Thom SR，et al.Hyperbaric oxygen and bone marrow-derived endothelial progenitor cells in diabetic wound healing.Vascular，2006，14:328-337.

3 Ziegelhoeffer T，Fernandez B，Kostin S，et al.Bone marrow-derived cells do not incorporate into the adult growing vasculature.Circ Res，2004，94:230-238.

4 Kalka C，Masuda H，Takahashi T，et al.Vascular endothelial growth factor(165)gene transfer augments circulating endothelial progenitor cells in human subjects.Circ Res，2000，86:1198-1202.

5 Saigawa T，Kato K，Ozawa T，et al.Clinical application of bone marrow implantation in patients with arteriosclerosis obliterans，and the association between efficacy and the number of implanted bone marrow cells.Circ J，2004，68:1189-1193.

6 顧福杭，羅玉賢，王雪平，等.血管腔內成形術聯合肝素注射療法治療嚴重糖尿病足.山東醫藥，2009，49:45-46.