苦參素抑制肝纖維化的臨床研究

張建榮 李麗華 范書平 張月鵬

肝纖維化(hepatic fibrosis)是機體對慢性肝損傷的一種修復反應，是一種漸進的病理過程，是慢性肝病的共有病理變化。肝纖維化的特征改變是肝臟內細胞外基質(extracellular matrix，ECM)的過度增生和異常沉積，嚴重者的肝纖維化可導致肝硬化，甚至引起肝功能衰竭［1］。目前從肝纖維化發生發展的不同環節入手研制了許多抗纖維化藥物，但仍未有十分確定、特效的藥物，因此，尋找理想的抗肝纖維化藥物及有關肝纖維化發病機制的闡明，具有重要的理論和臨床意義。苦參素(Oxymatrine)是從中藥苦豆子或苦參根中提取的一種生物堿，研究顯—示苦參素有防止肝纖維化的作用［2，3］，但其作用機制及調節途徑未完全明確。本研究從細胞因子水平進一步探討苦參素抗肝纖維化的作用機制，為苦參素的臨床防治肝纖維化提供指導。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2010年1月至2011年12月在本院住院的患有慢性肝纖維化的患者100例，隨機分為治療組和對照組。對照組50例，男45例，女5例;年齡28～52歲，平均年齡(40±6)歲;治療組50例，男44例，女6例;年齡26～55歲，平均年齡(40±8)歲。2組患者在年齡，性別和治療前肝功能檢測比較差異均無統計學意義(P＞0.05)，有可比性。

1.2 治療方法 2組患者均給予常規護肝及支持治療等一般治療。治療組在一般治療的基礎上給予苦參素氯化鈉注射液0.6 g(100 ml)，靜脈滴注，1次/d，療程 8 周，治療期間均不加用其他抗肝纖維化的藥物。

1.3 觀察指標

1.3.1 血清學檢查:對照組和治療組所有患者抽取靜脈血3 ml，離心后分離血清，送化驗室檢測。檢測項目如下:①肝功能指標檢測:利用HF-240全自動生化分析儀檢測丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉移酶(AST)、白蛋白(ALb)和總膽紅素(TBiL)的變化。②血清肝纖維化指標檢測:利用放免分析法檢測透明質酸(HA)、層黏蛋白(LN)、Ⅲ型前膠原肽(PC-Ⅲ)和Ⅳ型膠原(CⅣ)的變化。③轉化生長因子β1(TGF-β1)、白介素10(IL-10)和腫瘤壞死因子α(TNF-α)檢測:利用酶聯免疫吸附法檢測TGF-β1和IL-10;利用雙抗體一步夾心法酶聯免疫吸附試驗檢測TNF-α的變化。

1.3.2 肝穿刺后Ⅰ型膠原(CⅠ)和Ⅲ型膠原(CⅢ)檢測:對照組和治療組各10例患者經局部麻醉，在CT的定位和引導下經皮膚穿刺，獲取肝臟標本約15 mg。肝組織入4℃裂解液勻漿5 min，4℃離心，取上清，Bradford法測定樣本蛋白濃度。樣本蛋白經12%SDS-PAGE凝膠電泳分離，轉移至PVDF膜，脫脂奶粉室溫封閉2 h，1∶300稀釋的collagenⅠ，Ⅲ抗體和MMP13抗體4℃過夜，二抗(1∶3 000稀釋)與硝酸纖維素膜雜交。將膜置于ECL中1 min，曝光，顯影，定影。采用美國Kodak公司ID數碼成像分析系統軟件對Western blot結果進行定量分析，結果以目的蛋白與β-actin的積分光密度值的比值表示。

1.4 統計學分析應用SPSS 13.0統計軟件，計量資料以±s表示，采用t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 肝功能指標 對照組與治療組治療后ALT、AST和TBiL水平與治療前相比均顯著降低(P ＜0.05或 ＜0.01)，ALb水平與治療前相比顯著增加(P＜0.05);但2組治療后ALT、AST、TBiL和Alb水平比較差異無統計學意義(P ＞0.05)。見表1。

表1 2組治療前后肝功能指標比較n=50，±s

表1 2組治療前后肝功能指標比較n=50，±s

注:與治療前比較，*P ＜0.05，#P ＜0.01

組別 ALT(U/L) AST(U/L) TBiL(g/L) ALb(μmol/L)對照組治療前 208±32 154±28 39±10 34±5治療后 39±7# 36±8# 15±4* 40±5*治療組治療前 210±31 158±31 39±9 32±4治療后 36±12# 32±6# 16±4* 38±6*

2.2 血清肝纖維化指標 對照組治療后HA、LN、PC-Ⅲ和CⅣ水平較治療前無統計學差異(P＞0.05);治療組治療后HA、LN、PC-Ⅲ和CⅣ水平與治療前相比均顯著降低(P ＜0.01)。治療組治療后HA、LN、PC-Ⅲ和CⅣ水平明顯低于對照組治療后，差異有統計學意義(P ＜0.01)。見表2。

表2 2組治療前后血清肝纖維化比較n=50，±s

表2 2組治療前后血清肝纖維化比較n=50，±s

注:與治療前比較，*P ＜0.01;與對照組比較，#P ＜0.01

組別 HA(μg/L) LN(μg/L) PC-Ⅲ(ng/L) CⅣ(ng/L)對照組治療前 279±55 209±38 237±49 188±32治療后 269±32 191±36 218±43 186±37治療組治療前 280±31 211±48 234±41 186±30治療后 168±22*# 114±40*# 144±25*# 109±20*#

2.3 TGF-β1、IL-10 和 TNF-α 指標 對照組治療后 TGF-β1、IL-10和TNF-α水平較治療前差異無統計學意義(P＞0.05);治療組治療后HTGF-β1和TNF-α水平與治療前相比均顯著降低(P ＜0.05或＜0.01)，而IL-10水平與治療前相比顯著提高(P ＜0.05)。治療組治療后TGF-β1和TNF-α 水平明顯低于對照組治療后(P ＜0.05或＜0.01)，而IL-10水平明顯高于對照組治療后(P ＜0.05)。見表3。

表3 2組治療前后TGF-β1、IL-10和TNF-α比較n=50，±s

表3 2組治療前后TGF-β1、IL-10和TNF-α比較n=50，±s

注與治療前比較，*P ＜0.05，#P ＜0.01;與對照組比較，△P ＜0.05，☆P ＜0.01

組別 TGF-β1(mg/L) IL-10(μg/L) TNF-α(ng/L)對照組治療前 144±22 24±5 3.8±0.5治療后 137±16 22±4 3.7±0.3治療組治療前 147±32 25±5 3.9±0.7治療后 90±11#☆ 38±8＊△ 1.7±0.2＊△

2.4 Western blot法測CⅠ和CⅢ變化 對照組與治療組治療后CⅠ和CⅢ水平與治療前相比均顯著降低(P＜0.05或＜0.01);治療組治療后CⅠ和CⅢ水平明顯低于對照組治療后，差別有統計學意義(P＜0.05)。見表4。

3 討論

本研究通過血清學檢測發現，對照組和治療組治療后ALT、AST和TBiL水平降低，ALb水平顯著增加，提示兩種治療方法均有效的改善了肝功能。肝纖維化指標顯示苦參素治療組HA、LN、PC-Ⅲ和CⅣ水平與治療前相比均顯著降低。而對照組治療后沒有顯著改變，暗示苦參素具有改善肝纖維化的功能。細胞因子檢測和免疫印跡結果顯示苦參素氯化鈉注射液降低TGF-β1、TNF-α、Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原，升高IL-10了水平，提示苦參素改善肝纖維化的機制可能通過改變上述物質而發揮作用。

表4 2組治療前后CⅠ和CⅢ與β-actin比值的比較n=10，±s

表4 2組治療前后CⅠ和CⅢ與β-actin比值的比較n=10，±s

注:與治療前比較，*P ＜0.05，#P ＜0.01;與對照組比較，△P ＜0.05

組別 CⅠ CⅢ對照組治療前 1.9786 ±0.1363 2.3123 ±0.1578治療后 1.6385 ±0.0876* 1.9543 ±0.1352*治療組治療前 1.9689 ±0.1478 2.3476 ±0.1842治療后 1.3572±0.1476#△ 1.4558±0.3756＊＊△

研究顯示，肝星狀細胞的激活認為是肝纖維化過程中最重要的一步。HSC激活并轉化為肌成纖維細胞樣細胞，通過增生和分泌細胞外基質參與肝纖維化的形成，因此各種致纖維化因素均把肝星狀細胞作為最終靶細胞，其中TGF-β1和TNF-α是有力的致纖維化因子，調控肝內細胞外基質的合成與降解［3］。因此苦參素可以通過降低TGF-β1和TNF-α的合成而抑制肝星狀細胞的激活，起到抑制肝纖維化的作用。

細胞外基質包括膠原、糖蛋白及蛋白多糖等，其中膠原是最主要的成分，在肝臟中有Ⅰ型，Ⅲ型-Ⅵ型共5型，而以Ⅰ型和Ⅲ型為主。肝纖維化早期膠原沉積以Ⅲ型為主，后期以Ⅰ型為主，因此本研究中通過免疫印跡觀察到的Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原的降低進一步證實苦參素抑制了肝星狀細胞的激活，降低了Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原的合成，緩解了肝纖維化過程。此外，動物研究發現IL-10有抑制Ⅰ型膠原表達，促進膠原酶合成的作用，進而影響細胞外基質沉積，延緩肝纖維化進程［4，5］，這與本實驗觀察到的結果相一致，進一步證實了苦參素的抗肝纖維化作用。

因此，本研究通過臨床實驗研究發現苦參素作為一種中藥提取劑能夠抑制肝星狀細胞的激活，降低TGF-β1、TNF-α、Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原，升高IL-10了水平，緩解肝纖維化過程，為苦參素的臨床防治肝纖維化提供了新的理論依據。

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2 Liang JX，Qu XF，Zeng WT，et al.Mechanism of oxymatrine in preventing hepatic fibrosis formation in patients with chronic hepatitis B.Nan Fang Yi Ke Da Xue Xue Bao，2010，30:1871-1873.

3 Shi GF，Li Q.Effects of oxymatrine on experimental hepatic fibrosis and its mechanism in vivo.World J Gastroenterol，2005，11:268-271.

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