釋放膜微粒：間充質干細胞治療的新機制

李志勇 郭子寬 綜述 郭志坤 審校

間充質干細胞（Mesenchymal stem cells，MSC）是一類具有自我更新和多向分化潛能的成體干細胞，具有易于取材和體外擴增能力強等特點。此外，MSC免疫原性低，且具有很強的免疫調節作用。因此，作為細胞治療和組織工程的重要種子細胞，MSC已經進入臨床試驗階段。研究表明，MSC植入體內后，可分化為成骨和軟骨細胞，通過細胞替代的方式，進行骨和軟骨組織的修復，以治療骨關節炎、骨折后骨不連、半月板損失等疾病。此外，MSC也可參與包括血管、心肌、脊髓、腦等其它組織的修復，用于肢體動脈硬化、心肌梗死、脊髓損傷等疾病的治療。鑒于MSC明確的骨、軟骨和脂肪分化能力，且植入這些組織后外源MSC在短時間內死亡，人們有理由相信，MSC修復上述組織損傷的主要機制在于細胞的旁分泌作用。即MSC的分化和/或分泌作用，是治療不同疾病的機制所在。

例如，MSC能分泌多種細胞因子、趨化因子及生長因子，被認為是MSC參與心肌組織修復的主要因素。然而，利用心肌缺血再灌注模型研究發現，MSC條件培養基能明顯減少心肌梗死的面積，而當用濾膜去除條件培養基中的分子量大于1000 KDa的物質后，其對心肌的保護作用消失[1]。將分子量1000 KDa以上的物質進行靜脈輸注，又可恢復與先前幾乎相當的心肌保護作用。結果表明，心肌保護作用似乎不是直接源于分子量通常為十幾個KDa的因子，而具有磷脂包裹特性的、可與目的細胞快速結合的某種細胞亞結構，極有可能是MSC發揮生物學效應的主要成分。這種亞結構就是膜微粒（Micro-particles，MP）[1]。

近幾年的研究發現，外源MSC進入體內組織后，在應激或低氧低營養的條件下，可以通過出芽的形式產生膜微粒；后者作為一種細胞死亡或活化信號，可能承載著移植細胞修復其周圍組織的主要責任。

1 膜微粒的產生機制

雖然膜微粒表面抗原及胞質成分等與其來源細胞有很多相似之處，但膜微粒絕不僅僅是其來源細胞的“袖珍版”。膜微粒的釋放可能是多因素疊加的結果。在細胞激活途徑中，激活誘導物通過使細胞內的Ca2+聚集，導致轉位酶等多種酶效能降低或被抑制，進而使磷脂酰絲氨酸和磷脂酰乙胺醇不能被轉運到細胞內膜，最終導致細胞膜的磷脂雙層結構發生不對稱重排，磷脂酰絲氨酸暴露于細胞膜外側[2]。Ca2+濃度增加時，導致細胞骨架蛋白斷裂、重構，最終質膜出芽并脫落，微粒形成。在凋亡途徑中，膜微粒的形成依賴ROCKⅠ的激活，ROCKⅠ能促進肌球蛋白輕鏈的磷酸化并和肌動蛋白相互結合，引起細胞骨架的重排進而形成膜微粒[3]。

2 膜微粒的結構特點

幾乎所有的真核細胞，包括干細胞及前體細胞在內[4－5]，在接受刺激或凋亡過程中，均會通過質膜出芽的形式產生膜微粒。在質膜出芽過程中，包裹一定的細胞質，其中富含多種細胞因子、趨化因子、酶類、生長因子及信號蛋白[6]，某些細胞來源的膜微粒還含有功能性RNA及微小RNA[7]。這些微粒成分絕不是隨機包裹進來的，而是為實現某種生物學功能，通過某些未知機制組裝而成的。膜微粒作為一群細胞亞結構，能穩定存在于多種體液內[8]，體外反復超速離心或凍融均不影響其形態大小，但4℃或37℃保存可能導致膜微粒結構降解[9]。膜微粒呈球形結構，直徑約為40～1000 nm，約105 g的離心力作用1 h，完全可以使其沉積于管底。膜微粒的質膜富含脂質載體、膽固醇、鞘磷脂、神經酰胺和暴露的磷脂酰絲氨酸[10]。雖然不同的細胞時相或微環境能夠影響膜微粒的內容物，但MSC來源的膜微粒擁有一些共同的表面蛋白，如：CD81、CD9、CD63 及 Alix等透膜蛋白[11]。 此外，MSC-MP 還攜帶其母體細胞特有的黏附分子，如CD29、CD44、CD73等。間充質干細胞在凋亡過程中，不但釋放凋亡小體，而且可以釋放膜微粒等其他微囊物質。

值得注意的是，直至目前，人們尚未對膜微粒進行明確的定義。一般認為，膜微粒特點如下：①直徑在40～1000 nm，具有球形結構；②具有細胞骨架、磷脂雙層結構；③缺乏細胞核或缺乏合成蛋白的能力；④可以來源于不同的細胞，并表達來源細胞的表面特異抗原；⑤發生在細胞凋亡早期，高表達磷脂酰絲氨酸[12]。這些特點與內涵體和凋亡小體有很大的區別。內涵體在細胞受激活時產生且不具有Annexin V結合能力。凋亡小體的直徑可高達4000 nm，發生在凋亡晚期，具有Annexin V高親和力。

3 膜微粒發揮生物學效應的途徑

膜微粒表面有為數眾多的膜結合蛋白、膜錨定受體、黏附分子、細胞表面特異抗原等，通過這些細胞表面分子，膜微粒可以在不同的細胞之間進行信息的傳遞。在形成膜微粒的過程中，大量的細胞內含物（細胞因子、趨化因子、生長因子、信號通道蛋白等）及RNA和微小RNA[7]包被于膜微粒中。大量研究顯示，膜微粒可能主要通過兩種途徑發揮作用：第一，由于膜微粒中包含了大量的內容物（細胞因子、RNA及其表面活性脂質結構），因此膜微粒通過與目的細胞融合或直接釋放其內容物，從而激活細胞，改變細胞表型，使受體細胞功能發生改變[13]；第二，膜微粒可以通過其表面的分子與其相應的抗體結合從而激活目標細胞。目標細胞一旦被激活，即啟動相應的信號傳導通路，產生應答。同時，膜微粒不只停留存在于起源細胞的周圍，也可以隨血液循環遷徙至全身各處。因此，膜微粒以上兩種信號傳遞的途徑不止可以發生在其周圍細胞，即使遠離起源細胞的組織也可以受惠于其有益的修復作用。最近研究結果顯示，MSC-MP還可以趨化其他具有修復效應的細胞及細胞因子遷徙至損傷部位，促進細胞增殖分化，從而達到損傷修復的目的[14]。MSC來源的膜微粒可能通過以上途徑，將生物活性蛋白、生物脂類及功能核酸分子轉入受損目的細胞，使受損細胞得到恢復或使周圍的固有干細胞增殖，分化為功能細胞，從而恢復器官功能。

4 膜微粒臨床應用

研究證實，來源于MSC的膜微粒具有組織再生修復能力[15]和高效的免疫調節及細胞定向分化等功能[16]，多次直接心內膜注射MSC是相當安全的[17]。但是，Furlani等[18]發現靜脈注射MSC后，遠端末梢毛細血管出現阻塞現象及部分出現心律失常。動物實驗顯示，體內直接植入MSC，發現MSC向成骨和成軟骨細胞分化，且在不同組織中出現骨化和鈣化現象[19]。膜微粒的直徑足夠小，不僅可以快速通過毛細血管，到達病損部位，而且可以通過膜上受體與受損細胞結合，進而修復損傷組織；同時，也避免了直接注射MSC的不利生物學效應，減少了臨床風險。膜微粒內含物只有順利進入目的細胞內，才能發揮其修復作用[7]。這些因子可通過具有磷脂膜包被的膜微粒進入細胞，方式可能包括與目的細胞的融合、配體結合、胞吞及胞飲等多種途徑[20]，從而將有效的生物學成分轉運至特定的靶分子。這種活性物質轉運方式，避免了體內酶類及化學物質的降解，保證了細胞因子及核酸的穩定性、完整性及生物學能力。只要膜微粒的類脂膜不被破壞，膜微粒中的蛋白及RNA絕不會被胰蛋白酶及RNA酶降解[21]。膜微粒的膜表面存在為數眾多的膜蛋白（像轉鐵蛋白受體、腫瘤壞死因子受體及結合素類等），與目的細胞配體及胞外基質有高度的親和性。故而，在這些膜蛋白的作用下，膜微粒可以快速到達特異組織及微環境，同時，可能具有促使膜微粒內容物快速進入目的細胞的能力，加速治療蛋白或RNA進入受損細胞。總之，膜微粒不僅具有MSC治療的生物學特性，而且消除了MSC實施的弊端，有可能成為再生醫學研究中新的關注點。

5 膜微粒應用的前景及存在的問題

膜微粒具有保存穩定、方便，與目的細胞多途徑靶向性結合等優點，使其能夠特異性地作用于受損組織[22]。此外，MP的脂質膜結構能夠阻止各種酶類對其生物分子的降解，從而達到高效修復的目的。然而，膜微粒的提取和制備等規范化問題尚未解決，膜微粒與凋亡小體的分離、提純等問題均需要科學的解決辦法。來源細胞狀態及微環境等均可影響膜微粒的生物學性質及成分。Hood等[23]發現膜微粒可能通過促進血管再生，從而具有促進體內腫瘤生長的風險。這些安全隱患應得到重視。

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