乳腺（癌）干細胞與Wnt信號通路

陳旭東

（復旦大學上海醫學院 分子醫學教育部重點實驗室，上海 200032)

腫瘤的起源目前有體細胞學說和干細胞學說。如果說宇宙起源于大爆炸，那腫瘤則是細胞在人體里的大爆炸。惡性腫瘤是來自干細胞的大爆炸而良性腫瘤是來自體細胞的大爆炸，因為致腫瘤因子既要改變與“增殖”相關的基因或基因組，又要改變與“分化”相關的基因或基因組，而干細胞具有自主分化的功能，無需改變。本綜述以乳腺癌為例，介紹目前惡性腫瘤的基礎研究熱點和方向，著重說明干細胞的研究現狀。

1 乳腺(癌)干細胞

正常乳腺組織由乳腺干細胞分化而來。而腫瘤的干細胞假說則認為乳腺癌來源于分化不同階段的乳腺干/前體細胞的突變，這對乳腺癌的異質性是很好的解釋。由于以前缺乏特異的分子表面標記和體外培養系統以維持干細胞的未分化狀態，乳腺（癌）干細胞的分離和培養受到制約。Al-Hajj等[1]成功鑒定了乳腺癌干細胞為CD44+CD24-Lin-的細胞亞群。參照胚胎干細胞、神經干細胞的培養方法，目前已成功分離和培養乳腺干細胞：以“mammospheres”（乳腺細胞團）的形式，懸浮生長在無血清培養基上。并證實富含自我更新能力和分化成乳腺組織的三種細胞系（導管上皮、肌上皮、腺泡上皮）的未分化細胞。“mammospheres”亦含有ER+增殖前體細胞。若將“mammospheres”的細胞與成纖維細胞混合，在NOD/SCID小鼠的清潔乳腺脂肪墊上，可重建具有導管腺泡結構的正常乳腺組織[2-4]。依照同樣方法成功分離和培養了乳腺癌細胞系MCF-7及臨床標本的乳腺癌干/前體細胞[5]。基因表達譜分析提示，“mammospheres”與血液、神經及胚胎干細胞有顯著的重疊。影響干細胞自我更新的信號通路有Notch、Hedgehog、側翼蛋白（Wnt）、LIF等，前三者亦參與細胞命運的決定。正常干細胞與腫瘤干細胞共享某些特征：自我更新能力、端粒酶表達、分化能力、抗凋亡及特異位點的宿駐。腫瘤的轉移和復發可能與腫瘤干細胞有關，因此，腫瘤干細胞的研究成為熱點。

2 Wnt信號通路

由Wnt介導的信號通路在進化上高度保守，已知Wnt通路與細胞命運的決定、細胞增殖、細胞形態、遷移、凋亡、分化及干細胞自我更新有關[8]。Wnt信號通路包括經典的Wnt-β-catenin途徑和非經典途徑。前者通過Wnt蛋白與膜受體frizzled結合，通過β 鏈蛋白導致下游基因的轉錄激活。無Wnt信號，β-catenin滯留在胞漿，與抑癌基因APC（adenomatous polyposis coli）、axin及糖原合成酶激酶3（GSK3）形成復合物。GSK3能磷酸化β-catenin，啟動β-catenin的泛素化降解途徑。Wnt信號激活，GSK3抑制，阻礙了β-catenin的磷酸化，非磷酸化的β-catenin是穩定的，且能入核結合并激活轉錄因子TCF/LEF，導致下游基因（c-Myc、cyclin D1等）的轉錄激活[6-7]。因此，非磷酸化的、游離的β鏈蛋白是Wnt信號通路下傳的中心環節。β鏈蛋白尚與E-cadherin（一個重要的細胞黏附分子）的胞內段結合。非經典途徑可能通過如下三種機制：Wnt/Ca2+通路、Wnt/G蛋白通路和Wnt/PCP通路[9]（見圖1）。目前研究較多的是Wnt信號的經典途徑。

圖1 Wnt信號的經典途徑 (a）與非經典途徑（b）

3 乳腺(癌)干細胞與Wnt信號通路

Wnt基因家族成員的wnt-1、wnt-3和wnt-10b都是由小鼠乳腺乳頭狀病毒（MMTV）誘發小鼠乳腺癌的過程中活化的癌基因。小鼠wnt-1、wnt-2、wnt-3a、wnt-5a與wnt-7基因在體外均具有轉化細胞的能力。目前雖無明確證據表明，Wnt基因異常能直接導致人類腫瘤的發生，但是Wnt-5a在乳腺癌及早期乳腺增生中過度表達更為明顯，因此Wnt-5a具有癌基因的某些特性。 研究發現，乳腺癌中免疫組化檢測到核或胞質β-catenin水平增高；E-cadherin啟動子區被高度甲基化，低表達或失活的E-cadherin能使與膜結合β-catenin減少，導致胞內游離的β-catenin量增加，從而激活Wnt信號通路，使細胞發生轉化。因此，可以認為E-cadherin具有抑癌基因的功能[10]。抑癌基因APC與結腸癌發生的關系極為密切。結腸癌細胞中APC的失活可直接導致β-catenin在核內的累積；或β-catenin點突變抑制β-catenin蛋白磷酸化，不能降解，造成Tcf-4靶基因活化[11]。而在乳腺癌中均未發現APC的失活或β-catenin點突變。Wnt通路通過對乳腺生長發育的幾個階段產生影響，可能跟授乳期后的乳腺復舊有關。最近研究表明，在乳腺癌中，某些Wnt信號通路中的特異蛋白質的過表達或下調；如CKII及sFRP4的過表達及WIF-1和sFRP-1的下調，同時發現DVL-1的擴增[8]。通過細胞外給予Wnt拮抗劑FRP1及DKK1引起乳腺癌β-catenin水平下調，伴隨著細胞分化特征的改變[12]。更進一步的研究著眼于Wnt信號通路如何在不同組織類型的乳腺癌的發生，發展中起作用，以及是否促進乳腺（癌）干細胞的自我更新。

Wnt1是首個被克隆的小鼠原癌基因，其被插入MMTV后具有病毒介導的致癌作用[13]。隨后的MMTV.LTR-Wnt1轉基因小鼠亦證實小鼠乳腺小葉腺泡上皮增生，一年內100%小鼠產生乳腺腺瘤。MMTV.-Wnt1 轉基因小鼠亦成為廣泛應用的乳腺腫瘤動物模型[14]。例如以此模型構建LRP-5缺失突變體，發現了LRP-5-/-MMTV.-Wnt1轉基因小鼠乳腺發育延遲，產生抗腫瘤的表型[15]；發現了MMPs在腫瘤轉移中的作用[16]；以及發現了抑癌基因PTEN（Phosphatase and Tensin Homologue）的過表達對腫瘤的抑制作用[17]。更值得一提的是：通過對MMTV.-Wnt1轉基因小鼠動物模型本身的研究，發現腫瘤來源于TEBs（terminal end buds）細胞[18]。而TEBs細胞為公認的乳腺干細胞，故通過MMTV.-Wnt1轉基因小鼠，將乳腺干細胞-乳腺腫瘤-Wnt信號通路有機地結合在一起[19]。相信以MMTV.-Wnt1轉基因小鼠為基礎，通過針對Wnt信號通路中的關鍵蛋白質的基因，采用Knock in或Knock out技術，構建缺失突變體或基因的過表達，將對乳腺癌的分子生物學特性有更深入的了解。而且針對各種干細胞的自我更新的信號通路的抗腫瘤藥物，也在研發中，以便解決腫瘤的復發和轉移難題[20]。

[1] Al-Hajj M,Wicha MS,Benito-Hernandez A, et al. Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells[J].Proc Natl Acad Sci USA,2003,100(7):3983-3988.

[2] Gudjonsson T, Villadsen R, Nielsen HL, et al. Isolation,immortalization, and characterization of a human breast epithelial cell line with stem cell properties [J].Genes Dev,2002,16(6):693-706.

[3] Dontu G, Abdallah WM, Foley JM, et al. In vitro propagation and transcriptional profiling of human mammary stem/progenitor cells[J]. Genes Dev,2003,17(10):1253-1270.

[4] Woodward WA, Chen MS, Behbod F, et al. On mammary stem cells [J]. J Cell Sci,2005,118(Pt 16):3585-3594.

[5] Ponti D, Costa A, Zaffaroni N, et al. Isolation and in vitro propagation of tumorigenic breast cancer cells with stem/progenitor cell properties[J]. Cancer Res,2005,65(13):5506-5511.

[6] Polakis P. Wnt signaling and cancer[J]. Genes Dev,2000,14(15):1837-1851.

[7] Dontu G, Wicha MS.Survival of mammary stem cells in suspension culture:implications for stem cell biology and neoplasia[J]. J Mammary Gland Biol Neoplasia,2005,10(1):75-86.

[8] Howard B, Ashworth A.Signalling pathways implicated in early mammary gland morphogenesis and breast cancer[J]. PloS Genet,2006,2(8):e112.

[9] Liu S, Dontu G, Wicha MS.Mammary stem cells, self-renewal pathways, and carcinogenesis[J]. Breast Cancer Res,2005,7(3):86-95.

[10]Hiraguri S, Godfrey T, Nakamura H, et al. Mechanisms of inactivation of E-cadherin in breast cancer cell lines[J].Cancer Res,1998,58(9):1972-1977.

[11] Bienz M, Clevers H.Linking colorectal cancer to Wnt signaling [J].Cell,2000,103(2):311-320.

[12]Bafico A, Liu G, Goldin L,et al.An autocrine mechanism for constitutive Wnt pathway activation in human cancer cells[J].Cancer Cell,2004,6(5):497-506.

[13]Nusse R, Varmus HE.Many tumors induced by the mouse mammary tumor virus contain a provirus integrated in the same region of the host genome[J]. Cell,1982,31(1):99-109.

[14]Li Y, Hively WP, Varmus HE.Use of MMTV-Wnt-1 transgenic mice for studying the genetic basis of breast cancer[J].Oncogene,2000,19(8):1002-1009.

[15]Lindvall C, Evans NC, Zylstra CR, et al. The Wnt signaling receptor Lrp5 is required for mammary ductal stem cell activity and Wnt1-induced tumorigenesis[J]. J Biol Chem,2006,281(46):35081-35087.

[16]Blavier L, Lazaryev A, Dorey F.Matrix metalloproteinases play an active role in Wnt1-induced mammary tumorigenesis[J].Cancer Res,2006,66(5):2691-2699.

[17] Zhao H,Cui Y,Dupont J, et al. Overexpression of the tumor suppressor gene phosphatase and tensin homologue partially inhibits wnt-1-induced mammary tumorigenesis[J]. Cancer Res,2005,65(15):6864-6873.

[18]Li Y, Welm B, Podsypanina K, et al. Evidence that transgenes encoding components of the Wnt signaling pathway preferentially induce mammary cancers from progenitor cells[J].Proc Natl Acad Sci USA,2003,100(26):15853-15858.

[19]Brennan KR, Brown AM.Wnt proteins in mammary development and cancer[J]. J Mammary Gland Biol Neoplasia,2004,9(2):119-131.

[20] 李佳,房林.乳腺癌干細胞與其腫瘤治療的前景[J].中國普通外科雜志,2011,20 (5):533-535.