蛋白質組學在顳葉癲癇海馬組織中的研究進展

尹小花， 解文菁， 尹洪濤綜述， 孟紅梅審校

顳葉癲癇(temporal lobe epilepsy，TLE)是最常見的癲癇類型，大約占40%，且很大一部分為藥物難治性癲癇，有統計表明難治性癲癇中70%為TLE，故是目前研究的熱點。海馬硬化是TLE的特征性病理改變，包括海馬神經元丟失和異常苔蘚纖維出芽，常常繼發于最初的顱腦損傷，包括腦外傷、腦卒中、腦腫瘤、腦膜炎和腦炎、兒童時期的熱性驚厥以及癲癇持續狀態等，也有一部分病因不明。大量研究表明TLE的形成過程實際上是海馬可塑性神經網絡重建的過程，然而亦有人認為海馬的病理改變是反復癇性發作的結果。隨著后基因時代的到來，國內外許多學者運用比較蛋白質組學技術，通過比較癲癇患者或動物模型組與對照組的腦組織(大腦皮層、海馬)、體液(CSF)或亞細胞結構(線粒體)的差異蛋白質，發現了許多可能與癲癇相關的蛋白質，這為進一步闡明癲癇的發病機制提供了線索，為新型抗癲癇藥物的研發提供了分子靶點，并有利于耐藥機制的研究，目前在TLE、難治性癲癇、失神發作中已經取得了一定成果。現將蛋白質組學在TLE海馬組織中的研究進展綜述如下。

1 蛋白質組學概述

蛋白質組(proteome)的概念最早是由澳大利亞學者Wilkins和 Williams［1］提出，指的是一個基因組(genome)表達的全部蛋白質(protein)或一種細胞、組織、體液、生物體在特定時空上表達的全套蛋白質。蛋白質組學(proteomics)是以蛋白質組為研究對象，分析細胞內動態變化的蛋白質組成成分、表達水平與修飾狀態，闡明蛋白質之間的相互作用與聯系，以及在整體水平上研究蛋白質組成與調控的活動規律。蛋白質組學研究主要依賴4大技術:蛋白質分離技術、蛋白質鑒定技術、蛋白質相互作用分析及生物信息學。

任何一種疾病在表現出可察覺的癥狀之前，就已經有某些蛋白質在結構、表達數量、修飾方式與相互作用方面發生了變化。臨床上我們通過比較生理與病理狀態下細胞、體液或組織的差異蛋白質，即比較蛋白質組學，可以發現與各種疾病相關的特異蛋白，進而為闡明疾病的病因與發病機制提供線索，為疾病的診斷與判斷預后提供生物學指標，為疾病防治藥物的研發和篩選提供分子靶點。目前比較蛋白質組學技術廣泛應用于各種神經系統疾病中，如退行性疾病(阿爾茨海默病、帕金森病)、脫髓鞘疾病(多發性硬化、格林-巴利綜合征)、腦血管病和癲癇等，并取得了一定進展。

2 海馬蛋白質組學研究概況

功能上，海馬是邊緣系統的一部分，與學習、記憶、情感、應激和老化等有關，是目前多種疾病如阿爾茨海默病、精神分裂癥、抑郁癥、唐氏綜合癥和癲癇等的研究焦點。人類、大鼠和小鼠的海馬蛋白質數據庫分別于2004年［2］、2005年［3］和2006年［4］建立，促進了這些疾病的海馬蛋白質組學研究。

結構上，海馬分為CA1～CA4和齒狀回(DG)5個亞區，各亞區的結構、功能不同，對神經系統疾病的易損性也不同。另外，在海馬內存在一條三級興奮性突觸環路，即內嗅皮層神經元經穿通纖維投射至齒狀回顆粒細胞、進而經苔狀纖維投射至CA3區錐體細胞、再經Schaffer側支投射至CA1區錐體細胞，然而海馬可能還存在其他信息處理環路。因此，對海馬各亞區的蛋白質組學研究具有更重要的意義。Focking等［5］比較了正常海馬各亞區的蛋白質表達，發現 CA2/3與CA4、DG、CA1之間分別有74、66、55 個差異蛋白，神經膠質纖維酸性蛋白在CA2/3區表達顯著上調，表明這一區域星形細胞的數量增多或體積增大。這一發現有助于我們理解海馬環路內不同細胞的活動水平，其中星形膠質細胞的功能可能與氧化磷酸化和代謝活動有關。

3 TLE的海馬蛋白質組學研究

3.1 研究對象的來源 TLE的研究對象包括:(1)患者:主要是內側顳葉(海馬)硬化的手術切除標本，盡管有助于尋找人的癲癇相關蛋白。但缺點是一方面由于經濟原因及手術創傷大，標本來源受限;另一方面無法觀察差異蛋白的早期及動態變化過程。(2)動物模型:目前主要有兩種類型的TLE模型，第一種是應用興奮毒性物質(海人藻酸、匹魯卡品等)誘導急性癲癇發作，然后發展成自發性癲癇狀態;第二種是電刺激誘發慢性復發性癲癇。這些模型在癥狀學上表現為自發抽搐，證實海馬、杏仁核和其它邊緣結構在癲癇發病中占有中心地位;其病理上特異的海馬損傷與TLE的海馬硬化相似;另外這些動物模型對大部分抗癲癇藥耐受，符合TLE的臨床特點，因此為研究TLE提供了良好的實驗基礎，然而盡管如此仍無法準確模擬人的病理生理狀態。

3.2 TLE發病機制、海馬病理改變與蛋白質組學的相關性研究 TLE分為內側顳葉癲癇和外側顳葉癲癇，其中內側顳葉癲癇大部分屬于藥物難治性癲癇，其特征性的病理特點是海馬細胞結構異常，即海馬硬化。這部分患者往往外科手術治療有效，手術后能夠控制大約80%～90%的癇性發作。然而海馬硬化是內側顳葉癲癇的原因還是結果目前仍存在很大爭議，通過研究TLE海馬的蛋白質組學變化，有助于闡明TLE的分子發病機制和病理形成機制。

Yang等通過雙向凝膠電泳和質譜技術研究內側顳葉癲癇患者海馬的蛋白質組學變化，發現細胞骨架蛋白［6］、載脂蛋白A-I［7］、細胞內酰基輔酶A硫酯水解酶［8］和腦衰蛋白反應介導蛋白-2［9］表達異常，這些蛋白改變有助于闡明內側顳葉癲癇的分子發病機制。Jiang等［10］利用雙向凝膠電泳及基質輔助激光解吸附電離飛行時間技術，研究耐藥性癲癇大鼠海馬的線粒體蛋白質組學變化，結果鑒定出5種蛋白升高和14種蛋白降低，其中升高的電壓依賴性陰離子通道1和降低的電壓依賴性陰離子通道2可使線粒體ATP的生成減少和運輸障礙，最終導致能量衰竭和細胞凋亡，這可能與難治性癲癇的發病機制有關。

驚厥性癲癇持續狀態與繼發的海馬損傷和內側顳葉硬化有關。氯化鋰-匹魯卡品和海人酸誘導的TLE大鼠模型，經過急性癲癇持續狀態、靜止期、慢性自發性發作期3個典型的發病過程，可用來研究海馬損傷的分子和病理形成機制。Greene等［11］分析了匹魯卡品TLE大鼠癲癇持續狀態后早期的海馬蛋白質變化，發現熱休克蛋白-27、二氫嘧啶酶相關蛋白-2、細胞骨架蛋白和二氫蝶呤還原酶表達上調，這些蛋白可能與癲癇的病理機制、神經保護及神經元反應有關，因此通過調節這些蛋白表達可以抑制海馬損傷及繼發的癲癇形成。

海馬損傷與興奮性毒性有關，有證據表明氧化應激參與興奮性毒性損傷，然而具體的分子機制尚不清楚。Furukawa等［12］通過雙向電泳和質譜技術研究海人酸癲癇大鼠海馬的氧化損傷蛋白，結果發現熱休克蛋白-4、纈酪肽包含蛋白、線粒體內膜蛋白、α-互聯蛋白和絡氨酸3-單氧酶羥基化，因羥基化是蛋白質氧化的表現形式，故這些蛋白受到氧化損傷，推測可能與海人酸興奮性毒性導致的海馬神經元死亡有關，這些蛋白點可作為癲癇治療的潛在靶點來防治癲癇相關性神經元死亡。

內側顳葉硬化的病理特點之一是海馬齒狀回反應性膠質細胞增生和顆粒細胞軸突發芽，但其具體的分子機制尚不清楚。Li等［13］利用雙向凝膠電泳和液相色譜-串聯質譜研究普魯卡因TLE大鼠齒狀回的蛋白質組和磷酸化蛋白質組，結果發現有24個差異表達蛋白，其中包括9個磷酸化蛋白。這些蛋白在細胞結構形成及維持、突觸活動、能量代謝、細胞應激等方面發揮重要作用，推測可能與TLE海馬齒狀回的病理改變有關。

通過TLE海馬改變推測眾多基因與信號轉導參與其發病機制，然而無法通過患者腦組織研究癲癇早期階段的基因變化，為了研究TLE的動態發展的分子機制，Liu［14］等通過建立匹魯卡品TLE模型，利用雙向凝膠電泳技術研究大鼠海馬的急性期和潛伏期蛋白質組學變化，結果發現57種差異蛋白質，這些蛋白質根據生物學功能可以分成五大類，分別為細胞骨架蛋白、突觸相關蛋白、線粒體相關蛋白、離子通道蛋白和熱休克蛋白。國內學者榮佳［15］、張進［16］亦對氯化鋰-匹羅卡品TLE模型的海馬蛋白質組學進行了研究。綜合分析這些差異蛋白，推測TLE的分子發病機制可能與細胞骨架受損、突觸可塑性改變、能量代謝異常和氧化應激有關。

3.3 抗癲癇藥物作用機制、療效分析及靶點選擇的研究 Wu等［17］研究了內側顳葉癲癇大鼠丙戊酸治療后海馬的蛋白質組學，結果發現早期應用丙戊酸能夠防止致癇病理結構及自發癲癇的形成，故海馬蛋白質表達網絡的改變與TLE的形成密切相關，這些差異蛋白質點可作為抗癲癇治療的潛在靶點。Paulson等［18］研究了左乙拉西坦對大鼠海馬組織細胞增殖及蛋白質表達的影響，結果顯示左乙拉西坦并不影響海馬的細胞增殖，但能引起海馬蛋白質表達的變化，這些差異蛋白參與細胞骨架的形成及維持、能量代謝、神經傳遞、信號轉導、髓鞘形成和應激反應等生理過程，推測這些蛋白可能與左乙拉西坦的抗癲癇機制有關。鉤藤是一種中藥，具有抗驚厥效應，Lo等［19］研究了鉤藤對海人酸癲癇大鼠海馬蛋白質組學的影響，結果發現海人酸癲癇大鼠海馬的親環素A表達下降，鉤藤治療后表達上升，結果表明親環素A可能與鉤藤的抗驚厥效應有關。

Greene［11］、榮佳［15］等通過蛋白質組學的方法發現匹魯卡品TLE大鼠海馬組織中二嘧啶酶相關蛋白-2(DRP-2)表達上調。由于DRP-2能夠促進微管組裝，在軸突的生長、發育和分支以及神經元的再生、極性的建立和維持中發揮重要作用，故推測DRP-2與顳葉癲癇形成過程中海馬異常神經突起發芽導致的突觸重塑密切相關。因此調控DRP-2的表達或功能，可阻斷癲癇的發生、發展。研究表明［20］尼克酰胺對DRP-2有拮抗功能，能夠抑制培養的海馬神經元軸突生長，制止癇性發作，并已經被FDA批準作為治療部分性發作的輔助用藥。

反應性星形膠質細胞增生在癲癇的發生、發展中發揮重要作用［21］，而膠質纖維酸性蛋白(GFAP)是星形膠質細胞的主要成分及骨架蛋白之一，可用來特異性地標記星形膠質細胞，并被認為是星形膠質細胞活化的標志［22］。故深入研究GFAP表達的調控，有效控制星形膠質細胞的增殖，可成為治療癲癇的潛在手段。Xu等［23］通過免疫組化、蛋白質印跡和免疫熒光的方法發現癲癇大鼠海馬中磷酸化信號轉導和轉錄激活因子3(p-STAT3)和GFAP表達上調，而STAT3的磷酸化抑制劑AG490能夠抑制GFAP的表達，故推測p-STAT3在癲癇的發病機制中發揮重要作用，我們可通過調控STAT3的信號轉導通路來抑制GPAP的表達及反應性星形細胞膠質化，進而有效治療癲癇。

4 展望

蛋白質組學技術的開發和發展有助于我們發現有關TLE的形成機制、病理生理過程和臨床生物標記物，進而有利于尋找預防、診斷及治療方法。然而TLE的形成是一個復雜的生物過程，許多重要的基因、蛋白質和信號通路組成的生物網絡參與其發病過程。除了差異蛋白的研究，我們需進一步探索系統生物網絡中蛋白質的功能變化、蛋白質間相互作用、差異基因組和功能基因組，為研發新型抗癲癇藥物及尋求行之有效的治療手段提供依據。

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