蜈蚣敗毒飲對人臍靜脈內皮細胞增殖的影響*

楊素清蔡宏婷閆景東王姍姍

（1.黑龍江中醫藥大學附屬第一醫院，黑龍江哈爾濱150040；2.黑龍江中醫藥大學，黑龍江哈爾濱150040）

銀屑病是一種慢性、復發性、頑固性紅斑鱗屑性皮膚病，組織病理改變最先發生真皮乳頭層微血管異常增生。而內皮細胞在銀屑病血管生成中起關鍵作用，抗內皮細胞的分裂和增殖可抑制微血管的形成，從而達到治療銀屑病的目的 。本研究從抑制內皮細胞增殖的角度，通過實驗研究人臍靜脈內皮細胞（HUVEC），深入探討蜈蚣敗毒飲治療銀屑病的可能機制，為臨床應用提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑細胞培養瓶、培養板：美國Corning公司；細胞培養箱：TC2323D，廣州南方生化醫學部；倒置顯微鏡：XDS-1，重慶光電儀器總公司；超低溫冰箱：702ULTFreezer，U.S.A；臺式離心機：TGL-16G，上海安亭科學儀器廠；高速低溫離心機：Optima TMXL-look Ultracentrifuge，BECKMAN，USA；酶標儀：128C，奧地利；超凈工作間：黑龍江中醫藥大學中醫基礎理論實驗室；高糖DMEM培養基：美國Hyclone公司；胎牛血清：杭州四季青；青霉素/鏈霉素：美國Sigma公司；胰蛋白酶：美國Hyclone公司；D-Hank’s緩沖液：美國Hyclone公司；二甲基亞砜（DMSO）：美國Sigma公司；四甲基偶氮唑鹽（MTT）：上海華美公司；RPMI-1640培養基：美國Hyclone公司。

1.2 藥物蜈蚣敗毒飲，組成：蜈蚣3 g，烏蛇20 g，紫草30 g，鬼箭羽30 g，土茯苓30 g，甘草10 g。由黑龍江中醫藥大學附屬第一醫院提供。上藥加8倍量水浸泡4 h，煎煮1 h，藥渣再加6倍水煎煮，1 h后過濾取汁，將兩次濾出的藥液混合，分別濃縮成1.48、2.97、5.94 g/mL的濃縮液，4℃保存備用。甲氨蝶呤片，上海醫藥（集團）有限公司信誼制藥總廠生產，國藥準字：H31020644。將6片甲氨蝶呤片溶于134.41 mL蒸餾水中，配成濃度為0.11 mg/mL的混懸液，4℃保存備用。復方青黛膠囊，陜西天寧制藥有限公司生產，國藥準字：Z20010157。將36粒復方青黛膠囊溶于134.43 mL蒸餾水中，配成藥物濃度為0.13 g/mL的混懸液，4℃保存備用。

1.3 細胞與動物細胞：人臍靜脈內皮細胞株HUVEC，美國ATCC。健康清潔級Wistar大鼠36只，雄性，體質量（200±20）g，由黑龍江中醫藥大學實驗動物中心提供。室溫23℃飼養，空氣新鮮，自由飲水、攝食。

1.4 含藥血清制備36只Wistar大鼠隨機分成6組，即空白對照組、西藥對照組、中藥對照組、中藥低劑量組、中藥中劑量組、中藥高劑量組，每組6只。空白對照組大鼠每日灌服生理鹽水2 mL/100 g，根據公式（給藥劑量=臨床常用量×動物等效面積系數×培養基內血清稀釋度），中藥低、中、高劑量組分別灌服不同濃度的蜈蚣敗毒飲濃縮液（1.48、2.97、5.94 g/mL）2 mL/100 g，分別相當于成人所用劑量的5、10、20倍；西藥對照組灌服甲氨蝶呤片混懸液（濃度為0.11 mg/mL）2 mL/100 g，相當于成人所用劑量10倍；中藥對照組灌服復方青黛膠囊混懸液（濃度為0.13 g/mL）2 mL/100 g，相當于成人所用劑量10倍。每日分2次灌胃，連續3 d。末次給藥后1 h，大鼠經戊巴比妥鈉（35 mg/kg）腹腔注射麻醉，固定在手術臺上，無菌條件下腹主動脈取血。4℃靜置1 h，4℃離心（3000 r/min，5 min）分離血清，取上層血清56℃、30 min滅活，同組混勻，過濾除菌，分裝，-20℃保存備用。

1.5 HUVEC的培養、傳代、凍存及復蘇方法

1.5.1 細胞培養將細胞培養于含10%胎牛血清（56℃滅活30 min）、100 U/mL鏈霉、100 U/m青霉素的RPMI-1640培養液中，細胞接種于培養瓶中，在37℃，5%CO2，95%空氣，飽和濕度的培養箱中培養，2 d換液1次。

1.5.2 細胞傳代當細胞貼壁達80%～90%時，棄去原培養液，用D-Hank’s液清洗細胞2次，吸出D-Hank’s液。加入1 mL 0.25%胰酶溶液，輕輕晃動培養瓶，使其均勻分布于細胞表面。倒置顯微鏡下觀察細胞形態，發現細胞回縮、變圓，細胞間隙增大后，加入DMEM完全培養基終止消化反應。反復吹打細胞，使之成單細胞懸液，將細胞懸液接種入新的培養瓶中，繼續置于培養箱中培養。

1.5.3 細胞計數用無水乙醇清潔計數板及專用蓋玻片。制備單細胞懸液，取待測的細胞懸液0.1 mL，加D-Hank’s液0.9 mL，均勻混和后滴于細胞計數板上。計數四角的4個大方格內細胞總數（計左、計上壓線；細胞團≥2個細胞，按1個細胞計數）。按照下列公式算出細胞濃度：細胞濃度（細胞數/mL）=4大格細胞數之和/4×104×稀釋倍數。

1.5.4 細胞凍存將細胞用0.25%胰酶消化。加入DMEM完全培養基吹打，形成細胞懸液，轉移至離心管中離心（1000 r/min，5 min），棄上清液。按5×106個/mL的密度用細胞凍存液（完全培養基94%、DMSO 6%，于細胞凍存前配置）重懸細胞。分裝進凍存管，封口，標號。用多層脫脂棉包裹后，投入-70℃超低溫冰箱4 h，將凍存管裝入紗布袋中，置于液氮中保存。

1.5.5 細胞復蘇從液氮中取出凍存管，快速置于37℃水浴中，不斷振搖，使其在1 min內迅速解凍。取出凍存管，用75%酒精清潔管口，打開；吸出細胞懸液，置于含有DMEM完全培養基的離心管中離心（1000 r/min，5 min）。棄上清液，以DMEM完全培養基重懸細胞沉淀后，吹打均勻，使之成單細胞懸液。將其接種于細胞培養瓶內，倒置顯微鏡下觀察，置培養箱中培養，次日更換新鮮的培養液。

1.6 細胞分組及給藥方法 將HUVEC分為6組：即空白對照組、西藥對照組、中藥對照組、中藥低劑量組、中藥中劑量組、中藥高劑量組。將細胞以2×104/mL密度接種，在37℃，5%CO2，95%空氣，飽和濕度的培養箱中培養24 h。顯微鏡下觀察細胞己貼壁生長良好，吸棄上清液及未貼壁細胞，加入新的培養液培養（按DMEM∶胎牛血清∶含藥血清=8∶1∶1的比例培養）。空白對照組、西藥對照組、中藥對照組、中藥低劑量組、中藥中劑量組、中藥高劑量組加入的血清分別為空白血清、甲氨蝶呤片含藥血清、復方青黛膠囊含藥血清、中藥低劑量含藥血清、中藥中劑量含藥血清、中藥高劑量含藥血清。

1.7 觀察指標及檢測方法 采用四唑鹽（MTT）比色實驗測定蜈蚣敗毒飲對HUVEC細胞增殖的影響。用PBS制成5 mg/mL的MTT儲存液，過濾除菌后4℃避光保存。細胞以2×104/mL密度接種96孔板，每孔100 μL，每組設5個復孔。培養24 h后，顯微鏡下觀察細胞已貼壁生長良好，吸棄各孔上清液及未貼壁細胞，分別予以藥物處理，方法 同1.6項下方法 。培養48 h后吸棄孔內液體，每孔加入5 mg/mL的MTT 20 μL，繼續培養4 h。棄各孔液體，用PBS洗板2次，加入DMSO 100 μL/孔，震蕩10 min，使結晶物充分溶解。在490 nm波長用酶標儀檢測定吸光度值（OD值），實驗重復5次。按下列公式計算藥物對細胞增殖率的影響。細胞增殖率（RGR）=實驗組OD值/空白對照組OD值×100%。

1.8 統計學處理計量資料采用（x±s）表示，多組計量資料組間比較采用方差分析，如果多組均值比較有統計學差異，則采用兩兩比較方法 再進行分析，統計學處理采用SAS9.1。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

見表1。從表中可以看出，甲氨蝶呤片含藥血清、復方青黛膠囊含藥血清、蜈蚣敗毒飲含藥血清使體外培養的血管內皮細胞的存活率均有所降低，但只有西藥對照組、中藥中劑量組、中藥高劑量組與空白組比較HUVEC細胞增殖率差異有統計學意義（P＜0.05）；西藥對照組與中藥對照組及中藥低劑量組比較細胞增殖率差異有統計學意義（P＜0.05）；西藥對照組與中藥中劑量組、中藥高劑量組比較差異無統計學（P＞0.05）。中藥高劑量組與中藥對照組比較HUVEC細胞增殖率差異有統計學意義（P＜0.05），從上表中的數據可以看出，中藥高劑量組HUVEC細胞增殖率明顯低于中藥對照組。中藥低劑量組、中藥中劑量組HUVEC細胞增殖率與中藥對照組比較差異無統計學意義（P＞0.05）。

表1 各組HUVEC增殖比較（s）

表1 各組HUVEC增殖比較（s）

與空白對照組比較，*P＜0.05；與西藥對照組比較，#P＜0.05；與中藥對照組比較，△P＜0.05。

組別n細胞增殖率（%）空白對照組5100西藥對照組581.84±5.78*中藥對照組592.33±6.14#中藥低劑量組592.30±5.74#中藥中劑量組587.45±8.32*中藥高劑量組582.47±5.72*△

3 討論

銀屑病以角質形成細胞過度增生、真皮炎性細胞浸潤和新生血管形成為其組織病理三要素。其中真皮乳頭微血管的異常增生是其最早發生的病理過程。在銀屑病中表皮角質形成細胞加強了血管內皮生長因子（VEGF）的自我表達，并通過一系列信號傳導［1］，促進血管通透性增加及血管內皮細胞增生、遷移，最終導致新血管生成［2-4］。目前，銀屑病已經被確定為一種慢性炎癥性血管新生性疾病，銀屑病的皮損處可出現真皮乳頭層微血管擴張迂曲，通透性增高，血管數量增多。銀屑病的復發則與皮損內真皮乳頭內皮細胞的過度表達有關。血管新生是指由已經存在的血管床分生出新的血管，血管內皮細胞是血管新生體外研究的基礎。由此可見，內皮細胞在銀屑病血管生成中起關鍵作用，抗內皮細胞的分裂和增殖可抑制微血管的形成，從而達到治療銀屑病的目的 。內皮細胞已成為治療銀屑病的重要靶點［5］。

本研究結果 顯示，蜈蚣敗毒飲的含藥血清能夠明顯抑制HUVEC增殖，并且劑量越高增殖率越低。中醫學認為，銀屑病的病機較復雜，外有風、濕、熱、寒、內有血熱、血燥、血瘀，并與脾、肺等臟器密切相關，現代醫家從環境、地域、季節、體質等方面加深了對其病因病機的認識。但從臨床來看，從其初發來溯源，血熱是其病理基礎，“風”邪貫穿始終，“毒”邪作為一重要因素是致病的關鍵，“瘀”邪是其病理結果 。蜈蚣敗毒飲由蜈蚣、紫草、土茯苓、鬼箭羽、烏蛇、甘草6味藥組成［6-7］，從“風”、“毒”、“瘀”理論出發。方中蜈蚣辛溫燥烈，走竄性猛，行表達里，無所不至，息風止痙、搜風通絡、解毒，既有祛風又有解毒的雙重功用，故方以蜈蚣為君藥。紫草涼血通便，清解血分熱毒；土茯苓祛濕毒，兼能健脾胃、祛風濕；鬼箭羽涼血通經解瘀毒；上3味藥祛熱毒、瘀毒、濕毒，共為臣藥。烏蛇祛風通絡解毒，佐蜈蚣，剔除經絡之風，以疏外風，配蜈蚣以祛風毒，共為佐藥。甘草，解百毒，調和諸藥，為使。全方配伍嚴謹共奏祛風通絡、解毒祛瘀、清熱涼血之功。臨床研究［8］顯示效果顯著。因此蜈蚣敗毒飲可能是通過對內皮細胞增殖的抑制，從而抑制血管新生達到治療銀屑病的作用。

［1］ Creamer D，Sullivan D，Bicknell R，et al.Angiogenesis in psorias is［J］.Angiogenesis，2002，5：231-236.

［2］ Ferrara N.Vascular endothelial growth factor［J］.Eur J Cancer，1996，32：2413-2422.

［3］ Strawn LM，Mc Mahon G，App H，et al.Flk-1 as a target fortum or growth in hibition［J］.Cancer Res，1996，56：3540-3545.

［4］ Neufeld G，Gohen T，Genginovitch S，et al.Vascular endothelial growth factor（VEGF）and its receptors［J］.FASEBJ，1999，13：9-22.

［5］ Detmar M，Brown LF，Claffey KP，et al.Over expression of vascular permeability factor/vascular endothelial growth factor and its receptors in psoriasis［J］.J Exp Med，1998，180：1141-1146.

［6］ 楊素清，張曉紅，劉暢.蜈蚣敗毒飲對小鼠陰道上皮增殖細胞核抗原（PCNA）表達的影響［J］.中醫藥學報，2010，38（6）：25-27.

［7］ 楊素清，閆景東，王松巖.蜈蚣敗毒飲對雌激素周期小鼠陰道上皮細胞有絲分裂的影響［J］.中醫藥學報，2010，38（5）：33-35.

［8］ 楊素清，王姍姍.蜈蚣敗毒飲治療銀屑病的臨床研究及對血清IL-8的影響［J］.中醫藥學報，2011，39（6）：83-84.