桑仙降壓顆粒對自發性高血壓大鼠心肌MVD和ESM1蛋白表達的干預*

張蘊慧

（山東省中醫藥大學國家高血壓中醫臨床研究基地國中局中醫心病學重點專科，山東濟南250014）

高血壓的研究機理頗多，鮮有與微血管相關聯，然而微血管數目、質量降低導致的缺血性腦卒中、冠心病又嚴重影響著高血壓的預后，因此，高血壓微血管研究可能對預防心、腦、腎等靶器官損害起到積極作用。本研究將MVD及ESM1引入到高血壓研究中，通過微血管數目及血管生成因子的影響，來探討中藥預防高血壓及靶器官損害的機制，為臨床應用提供可引證的依據。

1 材料與方法

1.1 動物4周齡自發性高血壓大鼠，雌雄各半，體質量200～240 g，由中國醫科院阜外心血管醫院提供，醫動字第01-108號。4周齡Wistar大鼠，雌雄各半，體質量210～250 g，由山東醫科大學動物室提供，動物合格證號：SCXK（魯）20090001。

1.2 藥物桑仙降壓顆粒，組方：桑寄生、淫羊藿、丹參、川芎等，由山東中醫藥大學中藥制劑室按正交試驗法優選工藝制成，每克含生藥6 g，臨用前加蒸餾水稀釋成含生藥0.8 g/mL的藥液。吲噠帕胺片2.5 mg/粒，由天津力生制藥股份有限公司提供，實驗前加0.9%氯化鈉注射液適量，制備成濃度0.025 mg/mL的混懸液，置4℃冰箱保存備用，使用前振蕩，充分搖勻。

1.3 試劑生物素化山羊抗兔CD34抗體、生物素化山羊抗兔IgG，鏈霉親和素2生物素（SABC）和DAB顯色劑，均由武漢博士德生物工程有限公司提供；Anti-ESM1，為美國santacruz公司產品。

1.4 儀器METTLERAE20型電子分析天平，海特勒托利多（上海）儀器有限公司提供；康樂電熱恒溫水浴槽，上海醫療器件七廠提供；光學顯微鏡，由山東省中醫院病理科提供。

1.5分組與給藥以A標示正常對照組即wistar大鼠組；B、C、D分別標示自發性高血壓大鼠不同的給藥方式。B：自發性高血壓大鼠給予蒸餾水為空白對照組。C：自發性高血壓大鼠給予吲噠帕胺為西藥對照組。D：自發性高血壓大鼠給予桑仙降壓顆粒為試驗組。觀測時相點：0組的觀測時間為wistar大鼠、自發性高血壓大鼠4周齡。1、2的觀測時間為wistar大鼠、自發性高血壓大鼠給藥后4周、8周。在3個觀測時間點分別觀測，分組為A0、B0；A1、B1、C1、D1；A2、B2、C2、D2，隨機分組方法 ，每組6只。

1.6 標本采集用戊巴比妥鈉（40mg/kg體質量）腹腔注射麻醉后，立即經腹主動脈注入4℃0.9%氯化鈉注射液，切開下腔靜脈放血，待沖洗液干凈無色后，立即開胸，快速分離、摘取心臟，置入4℃0.9%氯化鈉注射液中快速沖洗3次，10%甲醛溶液固定，石蠟包埋，常規切片。

1.7 CD34標記MVD采用免疫組化SP法。結果 判斷：參照AXIOTIS等［2］的標準，由兩位病理醫生采用盲法（獨立檢測）在高倍鏡（×400）下讀片。每張切片高倍鏡下隨機選取10個不重復的視野（不足10個視野的，按實際觀察到的視野計數），共紀錄1000個細胞，綜合染色強度和陽性細胞數量進行判定。（1）按切片中細胞著色深淺評分：0分為細胞無顯色；1分為黃色；2分為棕黃色；3分為棕褐色。（2）按陽性細胞數占同類細胞數的百分比評分：1分為＜25%；2分為≥25%且≤50%；3分為＞50%且≤75%；4分為＞75%。取（1）、（2）兩項評分的乘積作為總積分：0～3分為（-）；＞3分且≤6分為（+）；＞6分且≤9分為（++）；＞9分（+++）。（-/+）為低表達，（++/+++）為高表達。

1.8 ESM1蛋白含量檢測由兩位病理醫生采用盲法（獨立檢測）在高倍鏡（×400）下讀片。每張切片高倍鏡下隨機選取10個不重復的視野（不足10個視野的，按實際觀察到的視野計數），共紀錄1000個細胞，綜合染色強度和陽性細胞數量進行判定。結果 判定同CD34。

1.9 統計學處理應用SPSS17.0統計軟件。計量資料以（x±s）表示。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組CD34表達比較見表1、圖1。實驗前，與正常對照組相比，空白對照組心肌CD34表達明顯減少，差異有統計學意義（P＜0.05）。實驗4周，自發性高血壓大鼠各組CD34表達減少，與正常對照組相比差異有統計學意義（P＜0.05）。與空白對照組比較，試驗組、西藥對照組CD34表達均有增多趨勢，但差異無統計學意義（P＞0.05）；實驗8周，與空白對照組比較，試驗組與西藥對照組CD34表達均明顯增多，差異有統計學意義（P＜0.01），兩組間差異無統計學意義（P＞0.05）。

2.2 ESM1蛋白含量檢測結果 比較見表2，圖2。實驗前，空白對照組大鼠ESM1蛋白光密度值與正常對照組相比差異有統計學意義（P＜0.05）。實驗4周，空白對照組大鼠ESM1蛋白光密度值降低，與正常對照組相比差異有統計學意義（P＜0.01）。與空白對照組比較，西藥對照組與試驗組ESM1蛋白光密度值均有升高，差異有統計學意義（P＜0.05）。實驗8周，空白對照組大鼠ESM1蛋白光密度值明顯降低，與正常對照組相比差異有統計學意義（P＜0.01）。與空白對照組比較，西藥對照組與試驗組ESM1蛋白光密度值均明顯升高，差異有統計學意義（P＜0.01）。兩組間相比差異無統計學意義（P＞0.05）。

表1 各組CD34表達積分比較（±s）

表1 各組CD34表達積分比較（±s）

與同觀測點正常對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與同觀測點空白對照組比較，△P＜0.01。下同。

實驗前實驗4周后9.56±0.689.43±0.71空白對照組實驗8周后正常對照組9.49±0.54組別n66 7.28±0.47*7.08±0.31*西藥對照組67.20±0.35*6.67±0.49*△試驗組67.15±0.40*6.43±0.77*△3.32±0.64**

圖1 各組CD34表達免疫組化染色（×400）

表2 各組大鼠ESM1蛋白光密度值表達積分比較（±s）

表2 各組大鼠ESM1蛋白光密度值表達積分比較（±s）

實驗前實驗4周后7.50±0.497.88±0.89空白對照組實驗8周后正常對照組8.03±0.45組別n66 7.04±0.56*5.78±1.45**西藥對照組66.02±1.717.54±0.98△試驗組66.43±0.697.79±1.21△△4.56±0.79**

圖2 各組ESM1蛋白表達免疫組化染色（×400）

3 討論

在本實驗中發現自發性高血壓大鼠在4周齡時，出現微血管數目明顯減少，并隨病程增加出現遞減趨勢，且高血壓伴其他危險因素、靶器官損害或臨床疾病，在降壓的同時，需要治療所有可逆性危險因素、靶器官損害以及各種并存的臨床疾病［2］。因此，在降壓的同時能夠保護微血管損害應成為防止高血壓引發心肌損害的重要措施之一。

微血管計數可根據血管內皮標記物來判定，在血管內皮標記物如Ⅷ因子相關抗原如CD31和CD34抗原中，以CD34抗原特異性最高，CD34被認為是最敏感的血管內皮標記物，因此CD34免疫組化染色可測量組織微血管密度和面積［5］，作為評價微血管密度的指標之一。實驗結果 顯示：實驗前，與正常對照組相比，空白對照組心肌CD34表達明顯減少；實驗4周、8周后與正常對照組相比，隨周齡增加空白對照組CD34蛋白表達逐漸增加，使用桑仙降壓顆粒劑、吲噠帕胺干預后，CD34蛋白含量較空白對照組明顯減少，表明4周齡SHR已存在微血管密度減少。在研究中筆者發現，桑仙降壓顆粒組在實驗4周時對微血管有保護趨勢，桑仙降壓顆粒、吲噠帕胺用藥8周可減輕SHR的微血管損害，但二者作用無統計學差異。

對微血管的保護依賴于血管生成因子，實驗所選擇的另一個指標是ESM1。血管內皮細胞在靜止狀態下，僅有短暫的、嚴密調控的血管生成，在正常成人組織，一些抑制血管生成的因子占優勢，在缺氧、藥物等因素的刺激下，促進血管生成的因子如VEGF等可大量釋放，使內皮細胞活化，形成新的血管，而ESM1因子正是與VEGF呈正相關的因子，因此本實驗選擇ESM1作為微血管生成的促進因子進行觀測。結果 顯示，實驗前空白對照組ESM1蛋白光密度值降低；而實驗4周、8周后ESM1蛋白光密度值的含量呈逐漸減少趨勢，使用桑仙降壓顆研究粒劑、吲噠帕胺干預后，ESM1蛋白光密度值的含量較空白對照組明顯增多，說明4周齡自發性高血壓大鼠心肌已有ESM1減少，桑仙降壓顆粒、吲噠帕胺用藥4周、8周均可促進ESM1的表達。

本實驗結果 提示，桑仙降壓顆粒劑具有保護微血管作用，其機理可能與增強ESM1蛋白密度值的表達有關。降壓療效確切的桑仙降壓顆粒［6］可很好地保護微血管，是否還可通過影響其他血管生成或抑制因子進而減輕靶器微血管損害，尚待進一步研究。

［1］ Abraham JA，Mergia A，Whang L，et al.Nucleotide se2quence of a bovineclone encoding the angiogenic Protein，ba2sic fibroblast growth factor［J］.Science，1986，233：545.

［2］ 2010年中國高血壓防治指南［J］.中華心血管病雜志，2011，39（7）：579-615.

［3］ Struijker Boudier.Arteriolar and capillary rem odelling in hypertension［J］.Drugs，1999，59 Spec No37.

［4］ 何作云，祝善俊.冠心病的微血管損傷研究進展［J］.中國循環雜志，2003，18（5）：R541.4.

［5］ 朱惠斌，陳懿，譚琥，等.腦泰方提取物對局灶性腦缺血大鼠CD34表達的影響［J］.中藥新藥與臨床藥理，2011，22（2）：141-144.

［6］ 張蘊慧.桑仙降壓顆粒對自發性高血壓大鼠平滑肌細胞Ki-67、bFGF的影響［J］.中西醫結合心腦血管病雜志，2004，2（5）：274-275.