更年寧神湯對圍絕經大鼠卵巢顆粒細胞caspase-3蛋白的影響*

潘愛珍 易偉民 陳克芳 李建軍

（中山大學孫逸仙紀念醫院，廣東廣州510120）

圍絕經期（更年期）綜合征是指女性從40歲以后到絕經后1年的這一時期，由于卵巢的衰老導致雌激素分泌功能減退而引起的一系列累及全身多器官的臨床綜合征［1］。筆者的前期臨床研究［2］表明中藥更年寧神方能顯著改善圍絕經女性患者血性雌激素水平和臨床癥狀。本實驗研究更年寧神方對圍絕經期大鼠顆粒細胞凋亡因子caspase-3表達的影響，探討其作用機制，為中藥治療圍絕經期綜合征提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑更年寧神湯組方：熟地黃20 g，山茱萸肉、女貞子、墨旱蓮、枸杞子、菟絲子、丹參、地骨皮、龜板、珍珠母各15 g，五味子、遠志、淫羊藿各6 g。購自康美中藥飲片廠，水煎并濃縮，相當于生藥1.0 g/mL，4℃冰箱中儲存備用。利維愛（主要成分為7-甲異炔諾酮）。半胱天冬酶-3（caspase-3）和β-actin兔抗鼠多克隆抗體及免疫組化染色試劑盒由廣東雅怡生物工程公司提供。

1.2 動物選用自然衰老雌性wister大鼠40只，月齡13～15月，體質量（330±20）g，由廣東省實驗動物中心提供，生產許可證號：SCXK（粵）2009-0003，經陰道脫落細胞涂片檢查，呈現出無動情周期，確定為圍絕經期鼠。飼養條件：二級實驗室，普通全價飼料喂養，自由攝水，室溫（24±2）℃，濕度45%～65%。大鼠適應性喂養1周后開始實驗。

1.3 分組與給藥將大鼠隨機分為4組：圍絕經期大鼠模型組、更年寧神方高劑量組（中藥高劑量組）、更年寧神方低劑量組（中藥低劑量組），西藥利維愛組。另選5個月月齡、體質量（180±20）g的雌性wister大鼠10只作為青年對照組（正常組）。更年寧神湯高劑量組給予5.68 g/（kg·d），更年寧神湯低劑量組1.42 g/kg，利維愛對照組給予利維愛溶液0.26 mg/（kg·d），圍絕經期對照組和青年對照組給予生理鹽水3 mL/（kg·d）。每日給大鼠灌胃1次，連續4周。大鼠末次給藥24 h后斷頭處死，快速取出雙側卵巢，經液氮速凍后于-70℃冰箱凍存，用于組織蛋白的檢測。

1.4 檢測指標

1.4.1 Westernblot法檢測卵巢中Caspase-3蛋白的表達提取大鼠卵巢總蛋白，進行SDS-PAGE轉膜，用質量濃度為30 g/L（0.03 g/mL）的牛血清白蛋白（BSA）37℃封閉1 h，加入兔抗鼠多克隆抗體（1∶200）37℃孵育1 h。TBST洗膜10 min×3次，TBS洗膜10 min。最后用ALP標記的山羊抗兔IgG（1∶500）37℃孵育1 h。TBST洗膜10 min×3次，TBS洗膜10 min。NBT/BCIP顯色，SageCreation凝膠成像系統分析條帶。以actin作為內參照。Caspase-3的表達水平以caspase-3與actin灰度比值表示。

1.4.2 免疫組化檢測卵巢Caspase-3蛋白的表達取大鼠一側卵巢以中性緩沖甲醛固定24 h，梯度酒精脫水、石蠟切片，水化，血清封閉，Ⅰ抗孵育，Ⅱ抗孵育，加底物，DAB顯色，蘇木素復染細胞核，切片脫水，透明，封片。根據切片中卵巢組織中卵泡內顆粒細胞免疫組織化學染色的深淺分4級，未被染色的為陰性表達（-），深棕色為弱陽性表達（+），棕黃色為中度陽性表達（++），棕褐色為強陽性表達（+++）。為了統計方便，予以半定量計分：1、2、3、4、分別對應-、+、++、+++。每張切片至少觀察3個視野。1.5統計學處理采用SPSS12.0軟件包進行統計分析，計量數據以±s）表示。成組設計資料采用t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Western blot結果 圍絕經期模型組大鼠卵巢中caspase-3蛋白表達高于正常組（P＜0.01），說明模型選擇能反應圍絕經大鼠的病理生理表現。更年寧神湯高劑量組、利維愛組大鼠卵巢中caspase-3蛋白表達低于模型組（P＜0.01）；中藥高劑量組與中藥低劑量組比較有統計學意義（P＜0.05）；中藥高劑量組與利維愛組比較比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。見表1、圖1。

表1 各組大鼠卵巢組織中caspase-3蛋白表達比較（±s）

表1 各組大鼠卵巢組織中caspase-3蛋白表達比較（±s）

與正常組比較，*P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與中藥低劑量組比較，#P＜0.05。

組別nncaspase-3正常組10100.38±0.04模型組10101.13±0.24*中藥高劑量組10100.46±0.07△△#中藥低劑量組10100.94±0.32利維愛組10100.41±0.18△△

2.2 免疫組化檢測結果 青年組卵巢顆粒細胞caspase-3蛋白多呈弱陽性（+）或陰性（-）表達，模型組總體上染色較深，呈強陽性或陽性表達，更年寧神湯高劑量組和利維愛組多呈弱陽性（+）表達，更年寧神湯低劑量組呈陽性表達，提示圍絕經期組與青年對照組比較caspase-3蛋白表達差異有統計學意義（P＜0.01），表明圍絕經期組卵巢顆粒細胞caspase-3蛋白表達明顯高于青年對照組；更年寧神湯高劑量組、利維愛組及更年康組比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。更年寧神湯高劑量組caspase-3蛋白表達低于低劑量組（P＜0.05）。見圖2。

圖1 各組大鼠卵巢組織中caspase-3蛋白Westernblot圖

圖2 各組大鼠卵巢顆粒細胞中caspase-3蛋白表達免疫組化圖

3 討論

中醫學認為，婦女進入圍絕經期，腎氣漸衰，天癸將竭，沖任二脈虛損。本病以肝腎虧虛為本，臟腑、陰陽、氣血失和在發病中亦起著重要作用。故治療關鍵重在滋補肝腎，調和陰陽氣血。更年寧神湯方中生地黃、山茱萸肉、女貞子、墨旱蓮、枸杞子、菟絲子可補腎肝脾三臟之陰，五味子、遠志安神斂汗，龜板、珍珠母滋陰潛陽鎮靜，淫羊藿溫腎補陽，陽中求陰，地骨皮退虛熱，丹參活血化瘀，一味丹參功同四物，麥芽疏肝護胃，調和諸藥，全方共具滋陰潛陽、清熱除煩、寧心安神的功效。

婦女進入圍絕經期卵巢功能衰退，卵泡閉鎖加劇，卵泡數量急劇減少，雌激素分泌減少，卵巢漸趨停止排卵。顆粒細胞為卵巢的主要功能細胞，其增殖與分化直接影響卵泡的生長啟動、發育、排卵、黃體形成及甾體激素分泌等卵巢功能活動，是卵泡不斷發育成熟的基本條件［3］。現代研究表明，卵母細胞的凋亡僅是卵泡閉鎖的開始，卵泡顆粒細胞的凋亡才是卵泡退化的根本原因［4］。細胞凋亡的發生最終依賴于caspaese家族凋亡蛋白酶的活化，它在細胞凋亡的執行過程中起關鍵作用［5］。Caspase-3是caspase家族中最重要的凋亡執行者之一，在細胞凋亡的執行階段，負責對全部或部分關鍵性蛋白的酶切（激活或滅活）。Caspase家族的級聯反應是調控凋亡的共同通路。卵巢閉鎖及黃體萎縮退化時發生細胞凋亡，特別是顆粒細胞，所以考察大鼠卵巢顆粒細胞凋亡促進因子Caspase-3表達變化對于了解性腺細胞凋亡的作用機制有一定意義。本實驗結果 顯示，caspase-3蛋白在模型組表達較高，免疫組化顯示其顏色較深，與正常對照組相比有顯著差異，中藥高劑量組更年寧神湯治療后，caspase-3蛋白其表達明顯降低，與模型組比較有極顯著差異，與利維愛組療效相當，低劑量組與模型組比較差異無統計學意義，說明更年寧神湯治療圍絕經期綜合征呈量效正比關系，其作用機制可能是通過降低Caspase-3蛋白的表達抑制卵巢細胞凋亡，從而起到延緩卵巢老化進程，從分子水平探討中藥復方更年寧神湯對圍絕經期衰老卵巢功能影響的可能機制。由此推斷，更年寧神湯對衰老卵巢功能的保護機制可能與抑制細胞凋亡密切相關。

［1］ 王翠霞，陳瑩.補腎復方對初老大鼠卵巢顆粒細胞凋亡相關蛋白Bcl-2，Bax表達的影響［J］.中醫藥學刊，2005，23（8）：1402-1403.

［2］ 李建軍，潘愛珍，易偉民.更年寧神湯治療陰虛內熱型更年期綜合征72例［J］.中藥材，2008，31（4）：628-630.

［3］ 盧翠玲，楊為巍，胡召元，等.顆粒細胞的增殖分化及其在卵泡發育中的作用［J］.科學通報，2005，50（21）：2341-2347.

［4］ Johnson AL.Intracellular mechanisms regulating cell survival in ovarian follicles［J］.Anim Reprod Sci，2003，78（3-4）：185.

［5］ 徐曉娟，金沈銳，秦旭化，等.補經合劑對初老大鼠卵巢細胞Fas，Caspases-3表達的影響［J］.中國中西醫結合雜志，2003，23（6）：193.