葛根素脂質體包封率測定及制備工藝優化*

郭 瑩李 莎

（1.浙江中醫藥大學，浙江 杭州 310053；2.浙江工業大學，浙江 杭州 310000）

葛根素具有防止血小板聚集、抗血栓［1］、改善血流［2］等作用，但其水溶性和脂溶性較差，生物利用度低，體內消除半衰期較短，需頻繁給藥［3］，限制了其應用。研究表明，脂質體對缺血心肌組織和細胞具有被動靶向作用［4］。將藥物包封于脂質體中可改善藥物體內的脂水分配系數，延緩藥物釋放，減少用藥劑量，提高生物利用度［5-6］。本實驗采用薄膜分散法制備葛根素脂質體，建立包封率的測定方法，并采用正交試驗優化葛根素脂質體的制備工藝，為葛根素脂質體的研究提供基礎。

1 材 料

752型紫外-可見分光光度計 （上海菁華科技儀器有限公司）；旋轉蒸發儀（上海申生科技有限公司）；SHB-Ⅲ循環水式多用真空泵 （鄭州長城科工貿有限公司）；SPS-2001型電子天平（上海海康電子儀器廠）；葛根素對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號：110752-200209）；大豆卵磷脂（國藥集團化學試劑有限公司，批號：W20100601）、膽固醇（國藥集團化學試劑有限公司，批號：F20080903）；磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉（分析純，湖州湖試化學試劑有限公司）；無水乙醇（分析純，安徽安特生物化學有限公司）；甲醇（色譜純，天津市四友精細化學品有限公司）；氯仿（分析純，浙江迪耳藥業有限公司）。

2 方法與結果

2.1 葛根素脂質體的制備

采用薄膜分散法制備：稱取處方量的大豆卵磷脂，膽固醇，溶于10mL氯仿，形成澄明溶液，置于茄型瓶中，38℃水浴旋轉蒸發除去有機溶劑，至瓶壁上形成均勻透明的薄膜。另取處方量的葛根素溶于20mL磷酸鹽緩沖溶液（PBS，pH＝7），加入上述附有薄膜的茄型瓶中，攪拌使薄膜溶解，形成混懸液，即得葛根素脂質體。上述葛根素磷酸鹽緩沖液中不加葛根素，同法操作即可制得空白脂質體。

2.2 葛根素脂質體包封率測定方法的建立

2.2.1 檢測波長的選擇 精密稱取葛根素對照品適量，用無水乙醇配成20μg/mL的溶液，以無水乙醇為空白溶液，在200～500nm的波長范圍內進行光譜掃描，見圖1。同法對空白脂質體的乙醇溶液掃描，見圖1。結果葛根素在250nm波長處有最大吸收，而空白脂質體在此波長無吸收，故確定用250nm波長作為葛根素脂質體的檢測波長。

圖1 光譜掃描圖

2.2.2 標準曲線的繪制 精密稱取葛根素10mg，置于100mL容量瓶中，用70%乙醇定容至刻度。精密吸取上述溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL，分別置于10mL的容量瓶中，用70%乙醇定容至刻度，搖勻，配成質量濃度為 2.0、4.0、6.0、8.0、10.0mg/L 的溶液。以70%乙醇為空白溶液，用紫外分光光度計在250nm波長處測定葛根素溶液的吸光度，以質量濃度C（mg/L）為橫坐標，吸光度A為縱坐標，進行線性回歸，繪制標準曲線，得y=0.0835x+0.0008，r=0.9998。

2.2.3 日內與日間精密度實驗 取低、中、高3種質量濃度（2.0、6.0、10.0mg/mL）葛根素乙醇溶液，1d 內連續 5 次測定吸光度，考察其日內精密度；連續測5d（每日1次）測定吸光度，考察其日間精密度。結果表明，用紫外分光光度法測定葛根素濃度精密度良好。

表1 日內精密度

表2 日間精密度

2.2.4 葛根素游離藥物的回收率實驗 見表3。精密量取0.5mL空白脂質體溶液，分別加入低、中、高3種質量濃度（2.0、6.0、10.0mg/mL）的葛根素乙醇溶液，用乙醇定容至25mL，測定吸光度，根據回歸方程計算葛根素實際質量濃度，計算回收率。結果表明游離藥物的回收率符合要求。

表3 游離藥物回收率

2.2.5 空白脂質體的干擾實驗 精密移取空白脂質體2mL，置于透析袋中，將透析袋置于250mL燒杯中，加入200mL PBS（pH=7），不斷攪拌，分別于 8、12、18、24h 取少量透析外液，用甲醇適當稀釋后250nm處測定吸光度，測得吸光度值為0，基本確定在24h內脂質體沒有泄露，對包封率的測定沒有干擾。

2.3 葛根素脂質體的處方優化 以包封率為指標，選取3個主要影響因素：磷脂與膽固醇質量比（A）、葛根素與磷脂質量比（B），葛根素在PBS中的質量濃度（C），每個因素取3個水平，進行正交試驗，試驗結果見表4，方差分析見表5。根據直觀分析結果：影響葛根素脂質體包封率的各因素的主次關系依次為：B＞C＞A，且均為顯著性因素，由此得出的最優搭配為：A2B2C1。故確定處方為大豆卵磷脂60mg，膽固醇30mg，溶于10mL氯仿中，作為有機相；5mg葛根素溶于20mL PBS中作為水相。結果制得的脂質體包封率為64.7%。

表 4 L9（34）正交試驗結果

表5 方差分析

2.4 初步穩定性實驗

將脂質體溶液分別置于冰箱 （4℃）、 室溫 （25℃）、40℃和60℃環境下，于1、2、3個月取樣觀測，以脂質體外觀和包封率為指標初步考察葛根素脂質體的穩定性。結果見表6，表7。結果表明制劑在4℃和25℃環境下，3個月內外觀和包封率無明顯變化。40℃環境下，第2個月開始包封率有所下降。60℃時，第1個月包封率即明顯下降，制劑也開始發黃變黏。因此，制劑應盡量低溫保存。

表6 不同溫度下時間對脂質體外觀的影響

表7 不同溫度下時間對脂質體包封率的影響（%）

3 討 論

脂質體的制備方法有許多種，如薄膜分散法、注入法、冷凍干燥法、硫酸銨梯度法等。薄膜分散法是研究最早，最簡單，現在也經常使用的一種制備方法。通過查找文獻和預實驗發現完全可以滿足葛根素脂質體的制備，故本實驗決定采取該法進行脂質體的制備。

包封率測定的關鍵是將未包封的游離藥物與脂質體分離，各種分離方法各有利弊。超濾離心所用的離心管一般是一次性的，成本較高。微柱離心法和葡聚糖凝膠柱法雖效果較好，但操作復雜，成本也較高。而透析法雖所需時間較長，但是操作簡便，所用的透析袋價格便宜，用量較少，并可重復使用，比較經濟，所以本實驗決定采用透析法進行游離藥物的分離。實驗中所建立的包封率的測定方法穩定可靠、且空白脂質體對濃度測定無影響。

正交設計優化葛根素脂質體的制備處方，根據實驗結果確定最優處方為：大豆卵磷脂∶膽固醇＝2∶1（m∶m），大豆卵磷脂∶葛根素＝12∶1（m∶m），葛根素脂質體包封率為 64.7%。初步穩定性實驗結果表明，制劑在4℃和25℃環境下，3個月內外觀和包封率無明顯變化；40℃環境下，第2個月開始包封率有所下降；60℃時，第1個月包封率即明顯下降，制劑也開始發黃變黏。因此，制劑應盡量低溫保存。

該項研究可為如何提高葛根素的生物利用度和體內靶向作用提供一定的實驗基礎和理論依據，為該制劑的開發提供借鑒。

［1］石瑞麗，張建軍.葛根素對缺氧性血管內皮細胞凋亡的保護作用［J］.藥學學報，2003，38（2）：103-107.

［2］劉健民，馬莉，何偉平.葛根素治療突發性聾的療效觀察［J］.第一軍醫大學學報，2002，22（11）：1044-1045.

［3］吳燕紅，蘇子仁，陳建南，等.從小鼠體內血藥濃度時間曲線與組織分布特征評價葛根素的給藥途徑［J］.中藥新藥與臨床藥理，2005，16（2）：112-115.

［4］張靈芝，唐朝樞.脂質體藥物載體靶向治療心血管病［J］.醫學研究雜志，2001，30（2）：15-16.

［5］黃義昆.脂質體作為藥物載體研究進展［J］.中國藥師，2005，8（7）：549-550.

［6］鄭寧，張立德.脂質體質量控制方法的研究概況［J］.中國新藥雜志，2004，13（12）：1282-1286.