高效液相色譜法中不同pH值對黃酮及有機酸分離效果的探討

曹 越 羅頌平 蘇薇薇 彭 維

1.廣州中醫藥大學科技處，廣東廣州 510405；2.廣州中醫藥大學第一附屬醫院婦科，廣東廣州 510405 3.中山大學生命科學學院，廣東廣州 510275

黃酮類與有機酸類化合物常同時存在于中藥藥材及中藥組方中，是植物中重要的天然產物，目前有關此兩類化合物的研究[1]越來越多。黃酮類化合物（flavonoids）[2]是一類存在于自然界的、具有2-苯基色原酮（flavone）結構的化合物。在植物體內分布廣泛，具有多1種生物活性，具有消炎鎮痛[3]、防治心血管疾病[4]、抗氧化[5]、抗癌[6]等方面也有顯著效果。有機酸類 （Organic acids）[7]是分子結構中含有羧基（-COOH）的化合物。在中草藥的葉、根、特別是果實中廣泛分布,為許多中草藥的有效成分，有一定的特殊的生物活性，例如金銀花中有機酸有抗血栓作用[8]，綠原酸具有抗氧化作用[9]，大青葉中的有機酸具有抗炎解熱的作用[10]。常用中藥益母草、玉米須、靈芝、金銀花、山楂、薄荷、刺五加等都富含黃酮化合物和有機酸類化合物，因此對于研究此2種化合物同時存在的植物的分析方法應用較為廣泛。

HPLC作為黃酮類及有機酸類物質分析檢測的常用方法，卻未見有研究流動相pH值對其分離效果及保留時間影響的報道。為此，本實驗考察了流動相pH值的微小變化對上述兩種物質的保留時間的影響，旨在為以上述兩類化學成分為主的植物的分析分離研究提供依據 。

我們通過實驗可證明pH值的變化對黃酮類與有機酸類化合物的分離效果影響非常顯著，含有此兩類化合物的物質對pH值的變化是非常敏感的。

1 材料與儀器

1.1 儀器與試劑

戴安Dionex公司高效液相色譜儀（ASI-100自動進樣器、ATH-58柱溫箱、P680四元梯度泵、PDA-100檢測器）；乙腈（色譜純，美國BJ），磷酸、甲醇均為分析純，水為超純水。

1.2 樣品制備

取富含黃酮類成份的植物桑寄生及含有有機酸成分的續斷粉末，按1:1質量比混合，以95%乙醇超聲提取2次，將醇提藥渣以蒸餾水100℃水浴加熱回流提取2次，用布氏漏斗減壓抽濾，濾液用旋轉蒸發儀減壓蒸干，加入甲醇溶解，用0.45μm的微孔濾膜濾過。

1.3 KH2PO4-H3PO4緩沖溶液的制備

將6.8g KH2PO4加入1000ml去離子水中，加磷酸數滴調節到相應 pH。（根據《中華人民共和國藥典》2005年版一部 附錄KH2PO4-H3PO4緩沖溶液的制備方法制備）。pH采用pH計測定。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent HC-C18 Analytical 4.6mm×250mm 5-Micron P.N.518905-902；檢測波長：220nm；流速：1mL/min；柱溫：25℃；分析時間85 min；進樣量10μL。流動相：乙腈(A)-(0.05mol/L)KH2PO4-H3PO4緩沖溶液 (B)，線性洗脫梯度，洗脫程序如下：0～65min乙腈10%→28%，65-85min乙腈28%→52%。

2.2 不同pH流動相比較

分別比較流動相為乙腈(A)-(0.05mol/L)KH2PO4-H3PO4緩沖溶液 pH=3.5，pH=3.0，pH=2.5 的分離效果，見圖 1、2、4，并以 pH=3.0為例，顯示各主要色譜峰的PAD圖，見圖3。

通過不同流動相不同pH值的色譜圖及疊加圖比較，可看出不同酸度，較為明顯影響黃酮和有機酸的分離，不同pH值下的各色譜峰的保留時間都不同，pH值為3.5時，最前端有機酸前移較多，與前一色譜峰無法分離，最后一個有機酸缺失，pH值為2.5時，前3個主要色譜峰無法有效分離，且第2及第3個有機酸黃酮出峰的先后順序發生顛倒，pH值為3.0時5個色譜峰得到有效分離，且峰形理想，根據色譜峰的PAD圖，出峰順序為有機酸、有機酸、黃酮、黃酮、有機酸(圖3)。因此優選pH值在3左右為流動相較為合適的pH值。?

圖1 乙腈-KH2PO4-H3PO4緩沖溶液pH=3.5為流動相，檢測波長為355nm的HPLC圖

圖2 乙腈-KH2PO4-H3PO4緩沖溶液pH=3.0為流動相，檢測波長為355nm的HPLC圖

圖3 乙腈-KH2PO4-H3PO4緩沖溶液pH=3.0為流動相主要色譜峰的PAD圖

圖4 乙腈-KH2PO4-H3PO4緩沖溶液pH=2.5為流動相，檢測波長為355nm的HPLC圖

圖5 乙腈-KH2PO4-H3PO4緩沖溶液pH=3.1為流動相，檢測波長為355nm的HPLC圖比較

圖6 乙腈-KH2PO4-H3PO4緩沖溶液pH=3.0與pH=3.1為流動相HPLC圖比較及兩特征色譜峰的紫外光譜圖

2.3 色譜條件pH值的確定

比較流動相為乙腈 (A)-(0.05mol/L)KH2PO4-H3PO4緩沖溶液pH=3.1，見圖5，pH=3.0的分離效果，并顯示pH=3.0及pH=3.5重疊圖的各主要色譜峰的PAD圖，見圖6。

圖7 不同pH乙腈-KH2PO4-H3PO4緩沖溶液為流動相，檢測波長為355nm的HPLC圖譜比較（從下到上以此為pH3.5，pH3.1，pH3.0，pH2.5）

從上圖可看出，HPLC色譜圖中黃酮類成分與有機酸對流動相的pH要求較嚴格，pH的稍稍波動在色譜圖中有較明顯的反映，pH=3.1比pH=3.0出峰提前，在pH=3.1時，第4個色譜峰黃酮苷與第5個色譜峰有機酸的分離度僅1.23，在pH=3.0時，分離度可達2.70，pH=3.0的色譜峰形比較好，且分離度較高。因此流動相選擇pH=3.0。

3 結語

在應用高效液相色譜進行物質分析時，可在無機流動相中加入酸、堿或緩沖溶液，以使流動相的pH值控制一定數值，抑制溶質的離子化，減少譜帶拖尾、改善峰形，提高分離的選擇性。pH值的變化對本系統的分析結果產生很大影響，黃酮、有機酸色譜峰的出峰時間、峰形、分離度等方面受pH影響較大，根據使用色譜柱的填料不同，本系統在pH3.0附近要進行微調，以達到黃酮苷與有機酸完全分離。

流動相pH值的調節是分析過程中至關重要的一個環節，本文通過比較黃酮與有機酸這兩大類物質分析效果的不同，指出準確調節流動相pH值的關鍵所在，有助于提高分析結果的準確性。pH值是影響色譜行為的主要因素之一，是流動相組成優化的最易調節和實現的因素。因此要重視準確調節流動相pH值重要性，這有利于我們更好的分析了解物質的色譜行為，有計劃的進行分離條件的選擇，減少不必要的錯誤的實驗嘗試。

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