支原體肺炎患者肺泡灌洗液中T細胞亞群的檢測

崔婷婷 郁 濤 何艷輝 張繼學 魏 靜 王中正 袁紅瑛

1 河南科技大學醫學院臨床專業08級，河南省洛陽市 471003； 2 河南科技大學醫學院

肺炎支原體（MP）肺炎在我國社區獲得性肺炎（CAP）中占有很高的比例，調查表明，在全國性CAP致病原中MP肺炎的比例達到了20.7%，已經超過肺炎鏈球菌，成為成人CAP的首要致病原，臨床上相關的研究也逐漸深入，但該病的發病機制還不十分清楚，其中免疫調節異常、呼吸道上皮細胞吸附及MP損害等在肺炎支原體肺炎（MPP）發病過程中可能起重要作用［1］。本研究將探討肺炎支原體感染時患者BALF中T淋巴細胞亞群變化規律，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 研究對象 病例選自2010年12月－2012年4月在河南科技大學第一附屬醫院呼吸內科病房住院肺炎患者180例，其診斷符合人民衛生出版社第7版《內科學》MPP的診斷標準［2］。在此基礎上，以咽拭子肺炎支原體培養陽性，且無其他病原感染的臨床及實驗室證據為診斷標準，共篩選出47例支原體肺炎患者（支原體培養鑒定試劑由南京黎明生物制品有限公司提供，操作及結果判定嚴格按說明書進行）。其中男25例，女22例，年齡25～71歲，平均年齡（36±4.6）歲，入選病例除符合MPP的診斷標準外，且不伴有肺結核、支氣管哮喘等其他呼吸道系統疾病，留取標本前未使用糖皮質激素、免疫抑制劑及免疫調節劑。對照組共30例，其中男17例，女13例，年齡23～70歲，平均年齡（31±4.7）歲。均為同期于本院呼吸內科病房住院的胸膜疾病（18例）或睡眠呼吸暫停綜合征（12例）的患者，近期無感染和慢性疾病史，且排除過敏性和免疫相關性疾病。對照組患者與MPP患者年齡及性別比較差異均無統計學意義。

1.2 標本采集 患者均在局麻下行纖維支氣管鏡檢查，并予支氣管肺泡灌洗術（患者簽字表示同意），其中，病例組根據影像學檢查提示及鏡下所見病變部位給予37℃無菌生理鹽水灌洗并回收BALF，將回收液體立即用雙層無菌紗布過濾除去黏液和痰液，裝入硅塑瓶中。對照組選擇右肺中葉或左肺舌葉，做與病例組一致處理，也裝入硅塑瓶中，立即送往實驗室。

1.3 BALF中T細胞亞群檢測 （1）標本制備：取肺泡灌洗液10～15ml，分裝于3～4只小試管中，離心1 800轉／min，15min。棄去上清，用PBS緩沖液收集管底沉淀細胞于一管中，離心1 500轉／min，25min；然后，吸取白色的單個核細胞層和少許紅細胞于另一個試管，加入5ml PBS混勻，離心1 500轉／5min；棄去上清，留取20μL細胞懸液，混勻，取5μL細胞懸液推片（制備好的標本在室溫中干燥2h以上或過夜再進入染色）。（2）染色步驟（于濕盒中室溫進行）：①標本放入固定液（甲醇∶丙酮＝1∶1）中固定90s，晾干，做好標記。②滴加一抗工作液10～15μL，60～90min。用PBS淋洗并浸泡2次，各5min。③滴加羊抗小鼠－生物素標記物10～15μL，30min。用PBS淋洗并浸泡2次，各5min。④滴加堿性磷酸酶－鏈霉卵白素工作液10～15μL，30min。用PBS淋洗并浸泡2次，各5min。⑤顯色：取1ml底物液溶解1mg堅固紅（現用現配）滴加適量液體于標本上，顯色10～30min（低倍鏡觀察，待細胞膜上出現明顯的紅色標記），自來水沖凈，晾干。⑥蘇木素復染3～5min，自來水沖洗；用0.5%氨水返藍5s，自來水沖凈，晾干。（3）結果：在高倍鏡下計數，計算其中CD3＋，CD4＋，CD8＋陽性細胞百分率及CD4＋／CD8＋。對照組也采用同樣方法測定BALF中CD3＋，CD4＋，CD8＋細胞數及CD4＋／CD8＋，比較分析。（所用試劑為北京賽馳生物科技有限公司生產的T淋巴細胞亞群免疫組化檢測試劑盒）。1.4 統計學分析 為消除批間誤差，采取統一藥盒，同一批操作人員檢測。研究中采用SPSS13.0軟件包對數據進行統計學處理；計量資料以均數±標準差（±s）表示，采用t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

T淋巴細胞亞群檢測結果：見表1。由表1可知，與對照組相比，肺炎支原體患者BALF中T淋巴細胞亞群的變化存在一定的規律，其中CD3及CD4水平下降，CD8明顯升高，CD4／CD8也明顯下降，組間差異有統計學意義（P＜0.05）。

表1 兩組T淋巴細胞亞群t檢驗結果（±s，%）

表1 兩組T淋巴細胞亞群t檢驗結果（±s，%）

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3 討論

肺炎支原體肺炎是MP引起的以肺間質病變為主的急性肺部感染，常伴有咽炎、支氣管炎、肺炎。臨床上將其與嗜肺軍團菌、肺炎衣原體及立克次體等非典型病原體引起的肺炎稱為“原發性非典型肺炎”。近年來，MPP發病率有不斷上升的趨勢，且其肺外并發癥如心肌炎、肝炎、腦炎的危害較大，從而引起臨床醫生的高度重視，成為臨床研究熱點之一［3］。MP的確診現在主要依靠實驗室檢查［4］。其中血清冷凝集試驗的臨床診斷價值不大；PCR方法實驗室要求較高；血清特異性抗體檢測3周后才可達到峰值，并受免疫功能等因素影響較大；檢測急性期和恢復期雙份血清，對其早期診斷和治療無任何價值，因此上述方法均有一定的局限性［5］。目前MP快速液體培養測定已作為許多醫院的首選方法，其可靠性已被臨床所證實，是MP實驗室檢測的首選方法［6］。

MPP的發病機制主要有呼吸道上皮的吸附作用、MP直接侵入和免疫學紊亂等學說，目前比較認可免疫紊亂學說［7］，其中T淋巴細胞介導的細胞免疫反應是機體對致病菌感染防御的主要措施，在支原體肺炎中起重要作用。T細胞分為不同的亞群，其表型、生物學特征及其在免疫應答中所起的作用各不相同。CD3＋細胞是成熟T淋巴細胞的特征性標志，反映了T淋巴細胞活化的比例；CD4＋細胞主要是輔助性T淋巴細胞，在抗細胞內病原體感染中發揮重要作用，它可以優先分化并引發吞噬細胞介導的宿主防御應答，并輔助T、B淋巴細胞應答；CD8＋細胞對非己抗原誘發的免疫應答產生抑制，它可以分泌穿孔素、釋放多種絲氨酸酯酶、分泌淋巴毒素殺傷靶細胞，甚至誘導細胞凋亡［8］。本組結果顯示，MPP組CD3＋及CD4＋淋巴細胞下降，說明T淋巴細胞活化功能受到抑制［9］；而CD8明顯升高及CD4／CD8比值的下降提示機體存在免疫功能紊亂，導致機體有效防御應答下降，引起組織損傷［10］。

總之，MPP感染與免疫調節紊亂密切相關，其在MP感染的發生中起到非常重要的作用。病例組CD3，CD4，CD8，CD4／CD8與對照組比較，存在一定的變化規律，可以用于MPP的輔助診斷。本研究說明，MP感染不僅需要抗MP治療，還應根據不同的臨床表現，加強對免疫系統的調節和控制。

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