四味藏木香軟膠囊中土木香內酯在人源Caco－2細胞單層模型中的吸收研究

安 濤，何 賀，郭?；?，王洪星

（青海大學 醫學院，青海 西寧 810001）

四味藏木香軟膠囊由藏木香、懸鉤木、寬筋藤、干姜四味藥組成，主要功能是治培根型木布病和促使瘟病初期的疫熱成型、虛熱癥、血痛病及涎痰病，呼吸不暢，食欲不振，兩肋刺疼，混合傳染病。研究表明，土木香內酯（C15H20O2）是藏木香的主要活性成分之一。Caco－2細胞系源于人的結腸癌，其體外作用過程與藥物在小腸的吸收具有相關性，因此，廣泛應用于揭示小腸上皮吸收的限速因素，評價藥物的吸收性。本實驗試圖通過對四味藏木香軟膠囊中藥物有效成分經腸吸收動力學方法研究，以彌補市場上只有此藥湯散劑的不足，進一步提高藏藥的療效，擴大使用范圍，減少使用劑量，方便給藥，為改進傳統藏藥劑型提供一定依據。

圖1 土木香內酯的化學結構式

1 材料與方法

1.1 實驗材料

細胞株Caco－2（ATCC＃HTB－37）購自美國 ATCC，土木香內酯（110760－201004）對照品購自中國藥品生物制品檢定所。甲醇（色譜純）、乙腈（色譜純，北京化工廠）、緩沖溶液（Hank＇s balanced salt solution，HBSS），實驗用二重水。四味藏木香軟膠囊（由青海大學醫學院中藏藥研究中心制作，批號批號201112）；DMEM 培養基（DμLbecco＇s modified Eagel medium，Hyclone公司）；胎牛血清（fetal bovine serum，FBS，equitech－Bio Inc.公司）；胰蛋白酶（Trypsin）購自北京華美生物工程公司；非必需氨基酸（nonessential amino acids，NEAA）購自美國Hy－clone公司；萘洛爾（proprnaolo1）、阿替洛爾（atenolo1）。

1.2 主要儀器

高效液相色譜儀（日本島津），LC－10AT 泵，ZA－100進樣器，N2000工作站，SPD－10A檢測器，SY1200T超聲波清洗器，ZF－1型三用紫外分析儀；電子分析天平（FA1004，上海良平儀器儀表有限公司）；ZS－H型恒溫水浴振蕩器（哈爾濱市東聯電子技術開發有限公司）；TGL－16C型高速臺式離心機（上海安亭科學儀器廠）。

1.3 實驗方法

1.3.1 細胞培養條件

Caco－2按“Caco－2細胞模型和標準操作規程”，采用內含10%胎牛血清、1%非必需氨基酸和青霉素－鏈霉素雙抗液的高糖DMEM培養基。將Caco－2細胞接種37℃含5%CO（相對濕度90%）培養皿中培養，每天換液，約5d后按1∶5比例傳代。將細胞按一定密度接種在Millicell膜上，種植密度為1×105個／cm2，種植后每天換一次液，培養至21～23d，體外培養至融合經檢測合格后，即可用于藥物的吸收、轉運和代謝試驗。本實驗選擇43～44代，電阻＞25Ω／cm2的Caco－2細胞單層。

1.3.2 攝取、轉運與外流實驗

將土木香內酯溶于甲醇中制成儲備液，實驗前以HBSS緩沖液稀釋至所設計的劑量濃度，分別在細胞兩側加入受試化合物和HBSS溶液（AP側400μL，BL側1200μL）。AP側給藥為攝取和轉運實驗；BL側給藥為外流實驗。用藥后于恒溫搖床（37℃ ，50r·min－1）上溫育。土木香內酯的給藥量為40μmol，溫育90min，分別收集AP側或BL側的溶液，單孔取點，每點平行3個孔。當AP側給藥時，給藥端AP側取樣300μL，接受端BL側取樣1100μL；當BL側給藥時，給藥端BL側取樣400μL，接受端AP側取樣350μL。所取樣品經冷凍干燥后分別加入不同體積的甲醇，給藥端均加入300μL，接受端均加入100μL，漩渦混勻后超聲溶解50min。離心20min，取上清液，用HPLC測定。

1.3.3 HPLC色譜條件

色譜條件：高相液相色譜儀：色譜柱：C18柱，4.6m×150mm，5μm；測定波長：220nm；柱溫：20℃ ；流動相：乙腈∶水＝55%∶45%；流動相流速：1mL／min。進樣量10μL。

1.3.4 表觀滲透系數的計算

土木香內酯在Caco－2細胞單層模型中的值按下式計算：Papp＝（dQ／dt）／SC。dQ／dt為接收池藥物出現的速率，S為膜面積，C為藥物的初始濃度。P值越大，通透率越高。用t檢驗對兩組數據進行比較處理。

2 結果

2.1 土木香內酯分析方法建立

精密稱取土木香內酯25.00mg，置25mL容量瓶中，以甲醇稀釋至刻度，配成1.00mg·mL－1的儲備液。精密吸取儲備液30μL加最后一次洗細胞的HBSS稀釋到3mL，再從中依次取1000、600、500、400、300、200、100μL，分別用 HBSS稀釋至1mL，冷凍干燥，加入甲醇溶解并定容為1mL；各濃度點取20μL，進樣分析。得到土木香內酯在濃度范圍0.1～1.0mg·mL－1內峰面積（Y）與濃度（X）的線性回歸方程為Y＝9.12×107X＋2.2×106，相關系數r＝0.9988。

圖2 土木香內酯對照品和轉運藥物的HPLC色譜

2.2 回收率實驗

AP側給藥，土木香內酯的給藥濃度為40μmol·L－1。溫育90min后，取AP側或BL和BL側或AP側液，按“1.2.2”項方法處理，按項“1.2.3”進行測定，按“1.2.4”項方法計算，得土木香內酯的平均回收率為95.80%，RSD＝1.03%。

2.3 攝取轉運實驗結果

AP側或BL側給藥，土木香內酯的給藥濃度皆40μmol·L－1。培育90min后，分別取AP側或BL側和BL側或AP側液，按“2.1”項方法處理，進行測定，按“2.2”項方法計算，土木香內酯AP側到BL側和從BL側到AP側的P值，結果見表1。同理在模型中用普萘洛爾（proprnaolo1）、阿替洛爾（atenolo1）做比較。

表1 土木香內酯在Caco－2細胞單層模型中的Papp值

3 討論

土木香內酯是四味藏木香軟膠囊的主要有效成分之一，具有多種藥理活性。本研究通過Caco－2細胞模型，研究土木香內酯跨膜轉運的機制從而探討土木香內酯小腸吸收轉運的機制，初步闡明土木香內酯在小腸中吸收的機制和藥物吸收的難易程度。建立土木香內酯在Caco－2細胞單層模型中的HPLC檢測方法，土木香內酯的峰面積與質量濃度線性關系良好，線性范圍為0.1～1.0mg·mL－1。應用該方法分別測定了AP側給藥轉運90min，時間點AP側和BL側液中原形土木香內酯的總殘存量，回收率（AP側和BL側的總和）為95.80%，說明它們在Caco－2細胞內基本無蓄積或僅有少量蓄積，對實驗結果分析不會產生影響。

根據文獻報道，在Caco－2細胞單層模型中，一般來說人體吸收完全的藥物Papp值大于10－5cm·s－1，而吸收差的藥物Papp值小于10－5cm·s－1，在此模型中我們將轉運良好的陽性藥物普萘洛爾和難吸收的藥物阿替洛爾的Papp值進行測定，得到普萘洛爾的Papp值為（2.32±0.11）×10－5cm·s－1；阿替洛爾的Papp值為（2.04±）×10－5cm·s－1與文獻報道的數據接近，而從表1我們可知土木香內酯的表觀滲透系數在吸收良好的藥物的范圍內，從腸腔側進入體循環（內流）與從體循環進入腸腔側（外流）的數據相差不大，并且PappA－B／PappB－A為0.67，在0.5～2.0之間，所以雙向轉運差異不大，初步說明土木香內酯在小腸上屬于被動轉運，受生物大分子的影響較小。因此，這些結果對四味藏木香軟膠囊的口服提供了一定的實驗和理論基礎。

近年來，土木香內酯被發現具有止痛作用，土木香根的甲醇提取物對人胃腺癌細胞（Mk－1）、人子宮癌細胞（HeLa）和鼠黑素瘤細胞（B16F10）具有抗增殖作用，此次在Caco－2細胞單層模型中的研究將對今后土木香內酯在這些疑難雜癥的研究方面提供一定的參考依據。

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