魚藤酮納米凝膠的制備與表征

馬莉，張志文，蔣世軍，薛大權

(1.湖北中醫藥大學藥學院，武漢 430065;2.中國科學院上海藥物研究所，201203;3.華東理工大學藥學院，上海 200237)

納米凝膠是一類交聯的聚合物粒子，是在水溶液中溶脹但不溶解的三維網狀結構體系，并具有納米級粒徑的水凝膠顆粒［1］。與其他載藥系統相比，納米凝膠載藥系統具有較高的藥物攜載能力和很好的穩定性［2］，因此引起廣泛重視。

目前的納米凝膠如三嵌段的泊洛沙姆、兩嵌段共聚物和三嵌段共聚物(如PCL-PEG-PCL)等，都因為自身的欠缺如不易生物降解、不以溶液形式存在、降解速度太慢等限制了其應用［3-4］。三嵌段聚合物P LGAPEG-PLGA是一種可溶于水的兩親性高分子聚合物材料，其在水中可自組裝形成納米膠束，而在外界環境因素如pH、離子強度、溫度等的影響下可以產生物理交聯［5］，形成納米凝膠。該聚合物具有良好的生物相容性，可生物降解，可顯著提高藥物的化學穩定性，對水中不穩定的藥物具有應用價值［6］。PLGA-PEG-PLGA聚合物具有類似表面活性劑的作用，能夠顯著增加難溶性藥物的水溶性，而且具有熱敏性，其膠束溶液在生理溫度可轉化成納米凝膠，實現藥物的緩控釋放［7］。魚藤酮是一種線粒體復合體Ⅰ抑制藥，近年來常被國內外學者用來模擬人類帕金森病［8］，但魚藤酮是一種容易降解的難溶性藥物，在水中的溶解度僅為15 ng·mL－1。筆者在本實驗中以 PLGA-PEG-PLGA聚合物為材料，制備魚藤酮納米凝膠(rotenone loaded nanogel，RNG)，以期改善藥物的水溶性，控制藥物釋放。

1 材料與方法

1.1 儀器 Waters Alliance高效液相色譜儀(美國Waters公司)，Malvern Zetasizar Nano ZS90粒徑測定儀(英國Malvern公司)，DSC 822e差示掃描量熱分析儀(瑞士Mettler公司)，Rigaku X射線衍射分析儀(日本Rigaku公司)，Buchi R-114型旋轉蒸發儀(瑞士Büchi公司)，85-2型恒溫磁力攪拌器(上海廣英儀器有限公司)，Millipore純水儀ZLXS5003(美國Millipore公司)。

1.2 試藥 魚藤酮(上海岸美實業有限公司，純度:90%)，PLGA-PEG-PLGA三嵌段聚合物(由第二軍醫大學提供)，聚山梨酯80(上海國藥試劑有限公司，化學純，批號:F20100517)，丙酮(上海國藥試劑有限公司，分析純，批號:T20101020)，乙腈(Merck公司，色譜純，批號:T20100809)，其余試劑均為分析純。

1.3 RNG 的制備 采用薄膜分散-水化法［9］制備RNG:精密稱取處方量的PLGA-PEG-PLGA聚合物和魚藤酮，置于圓底燒瓶中，加入適量丙酮，攪拌使之完全溶解，然后減壓蒸發除去有機溶劑，在燒瓶壁形成薄膜，加入4℃超純水，在冰浴中攪拌約5 min，于4℃條件下水化形成具有淡藍色乳光的澄清液體，即得最大濃度為10 mg·mL－1的RNG。同法制備不含藥物的空白納米凝膠作為對照。

1.4 RNG理化特性表征

1.4.1 粒徑分布及Zeta電位 采用馬爾文粒徑測定儀測定10 mg·mL－1RNG及空白納米凝膠的粒徑分布特性，具體條件如下:激發光波長50 mW，測量角度90°，測量溫度25℃。轉換到Zeta電位測定模式對納米粒表面電荷進行測定。

1.4.2 差示掃描量熱 (differentialscanning calorimetry，DSC)法 為考察魚藤酮在納米凝膠中的分散狀態，采用DSC法測定RNG熱力學行為。具體操作如下:分別精密稱取魚藤酮原料藥、凍干空白納米凝膠和凍干RNG3～5 mg于鋁制小坩堝中，加上鋁蓋密封。在30～240℃溫度范圍內，以10℃·min－1升溫速率加熱進行DSC分析，測定各樣品在程序升溫過程中吸收峰或放熱峰的變化。

1.4.3 X 衍射分析(X-ray diffraction，XRD) 為進一步考察RNG中魚藤酮的分散特性，采用XRD技術考察藥物在納米凝膠中的晶型狀態。具體操作如下:分別稱取魚藤酮原料藥、凍干空白納米凝膠和凍干RNG填充于樣品皿中。實驗條件為:Ni濾波器，Cu靶，40 kV電壓，40 mA 電流，DS=SS=1 °，RS=0.3 mm，掃描速度為4 °·min－1，步寬為0.02 °，掃描范圍為 5 ～60°，繪制X射線衍射圖。

1.5 體外釋放 建立定量檢測魚藤酮濃度的高效液相色譜法，探討RNG在不同釋放介質或者不同藥物濃度下的釋放特性。

1.5.1 色譜條件 Waters高效液相色譜儀系統(2695-2487)，色譜柱:Zobax C18柱(150 mm×4.6 mm，5μm，Agilent);流動相:乙腈-水 =55∶45［10］;流速:1 mL·min－1;柱溫:40 ℃;檢測波長(A):295 nm;進樣量:20 μL。

在此色譜條件下定量檢測魚藤酮的含量，魚藤酮的保留時間為 8.0 min。配制 0.5，1.0，2.0，4.0，8.0，16.0 μg·mL－1魚藤酮對照品溶液，經高效液相色譜分析，以魚藤酮濃度為橫坐標(X)，峰面積為縱坐標(Y)，得標準曲線方程為 Y=34.395X+1 191.9(r=0.999 9)，線性范圍0.5 ～16 μg·mL－1，最低定量限為0.1 μg·mL－1。

1.5.2 藥物釋放 分別考察納米凝膠中藥物濃度和不同釋放介質對其藥物釋放的影響。首先在釋放介質為含有2.0%聚山梨酯80的磷酸鹽緩沖液(pH7.4)的條件下，考察樣品濃度為5和10 mg·mL－1對藥物釋放的影響;其次是樣品濃度為10 mg·mL－1，考察釋放介質分別為含有0.5%，1.0%，2.0%聚山梨酯80的磷酸鹽緩沖液(pH7.4)對藥物釋放的影響。精密量取樣品1 mL 置于 1.5 cm×1.8 cm 小試管中［11］，置于 37℃搖床中待凝膠膠凝(約10 min)［12］，將凝固好的凝膠試管加入釋放介質100 mL中，于(37±0.5)℃空氣浴振蕩，振蕩頻率為 100 r·min－1。分別在 0.5，1.5，2.5，3.5，4.5，6.5，8.5，10.5 d 取釋放介質溶液50.0 mL，并及時補充相同溫度和體積的釋放介質。取所取溶液1 mL 以12 000 r·min－1離心10 min，取上清液，采用高效液相色譜法檢測。

2 結果

2.1 粒徑分布及Zeta電位 由粒徑分布測定結果可知，RNG呈單峰分布，多分散系數為0.190，粒徑分布窄，平均粒徑120 nm。空白納米凝膠的平均粒徑為80 nm，多分散系數為0.240。因此加入藥物后，納米凝膠的粒徑顯著增大，而多分散系數則未有顯著變化。Zeta電位測定結果表明，RNG電位幾乎為0 mV，表面呈電中性。

2.2 DSC掃描分析 由DSC曲線可見，魚藤酮原料藥在約165℃有一尖銳的吸熱峰，此為該原料的特征峰;在空白納米凝膠中沒有出現吸熱峰，DSC曲線在160℃之后緩慢上升;在RNG中，其DSC曲線與空白納米凝膠類似，魚藤酮原料藥的特征峰完全消失，而且DSC曲線上沒有出現吸熱峰特征峰。因此，RNG中魚藤酮可能以無定形或者分子形態均勻分散在納米凝膠中。

2.3 XRD結果 對RNG衍射分析繪圖，由圖可知，魚藤酮原料藥在 7.5，12.1，15.6，17.5，18.6，20.18，21.54°等處存在多個特征峰，而空白納米凝膠中僅在10～28°間有一寬峰，在RNG中，其XRD與空白納米凝膠幾乎一致，原料藥的特征峰全部消失。這些結果表明魚藤酮在納米凝膠中主要以非晶型的形式完全分散在納米凝膠中。

2.4 體外釋放 兩組樣品的體外釋藥曲線如圖1所示，10 mg·mL－1制劑比 5 mg·mL－1體外釋放快，藥物由進入凝膠框架的介質溶解后，經凝膠中的孔道而擴散到介質中，藥物濃度越大擴散越快。由圖2可見，在不同的釋放介質中，釋藥速率:2.0%聚山梨酯80＞1.0%聚山梨酯80＞0.5%聚山梨酯80，在約第10天，含2.0%聚山梨酯80的介質累計釋放量已達到40%，是1.0%聚山梨酯80的1.4倍，是0.5%聚山梨酯80的2.1倍，表明釋放介質中加入聚山梨酯80可促進RNG的釋放，并隨聚山梨酯80濃度增加釋放速度加快，釋放維持時間縮短。

3 討論

薄膜分散法廣泛用于脂質體、固體脂質納米粒等納米制劑的制備，筆者采用該方法制備RNG。研究結果表明，制備的RNG平均粒徑120 nm，粒徑分布均勻(多分散系數0.190)，而且具有良好的穩定性。由于聚合物材料對于溫度具有敏感性，而且魚藤酮容易降解，制備過程需要在較低溫度下進行，筆者采用4℃超純水水化，并在冰浴、避光條件下攪拌，加速其制備過程，增加模型藥物的穩定性［13］。

難溶性藥物的水溶性以及釋放特性與其晶型和分散狀態密切相關。筆者在本實驗中采用薄膜分散法制備RNG，藥物與聚合物材料共同溶于有機溶劑中，然后減壓除去有機溶劑，藥物與材料能夠均勻分散，而且聚合物能夠抑制晶體的形成，從而有利于提高難溶性藥物的水溶性。DSC和XRD測定結果表明，魚藤酮主要以無定形形態或分子狀態均勻分散在納米凝膠中，而且藥物在水中的溶解度提高了600倍以上。因此，筆者成功制備了難溶性藥物魚藤酮的納米凝膠制劑，能夠顯著提高其在水中的溶解性，并且能夠顯著改善藥物的釋放特性。

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