瓊脂糖凝膠中DNA檢測方法的研究進展

尤偉靜，陳茂，馬衛德，叢維濤，金利泰

作為研究生命遺傳物質載體——核酸的工具，瓊脂糖凝膠電泳已成為高效分離和分析核酸分子的必備手段，而在電泳后對 DNA 的檢測是關鍵環節，因為它直接關系到實驗結果顯現與否。目前，常用的瓊脂糖凝膠上 DNA 檢測方法有熒光染色法、染料染色法、金屬離子染色法、負染法等。近幾十年來，許多研究者對染色方法進行了改進，使靈敏度和線性動態范圍都有較大程度提高。本文主要對瓊脂糖凝膠電泳后的 DNA 檢測技術方面的研究歷程進行總結，并展望其未來的發展方向。

1 各種 DNA 染色方法

1.1 熒光染色法

熒光染色法是檢測 DNA 的一種常用分析技術。目前，用于瓊脂糖凝膠上 DNA 研究和測定的熒光染色方法有Hoechst 33258、Pico Green[1]、YOYO、TOTO[2]、EB 染色法[3]、生物素染料染色法[4]、DAPI[5-6]、SYBR Green I 染色法[7-10]、SYBR Gold 熒光染色法[11]等。

LePecq 和 Paoletti[12]觀察到 EB 染料與 DNA 結合時其熒光性增強的現象，此后在 1973 年，Sharp 等[13]首次將EB 法引入電泳凝膠上 DNA 的檢測，并獲得較好的效果，自此該檢測方法就被廣泛地應用于 DNA 的研究[14]。EB 染色法作為瓊脂糖凝膠上 DNA 檢測最經典的染色方法，具有操作快速、簡便，對 DNA 專屬性高，同時可滿足大部分的實驗要求。但它卻具有兩個比較嚴重的缺點：①EB 能嵌入 DNA 分子雙螺旋結構中破壞 DNA 樣品，從而具有較強的致畸、致突變作用，對實驗操作者具有潛在危險；②EB 檢測的凝膠需要在紫外燈下進行檢識，而紫外射線常常導致核酸雜交、聚合[15-16]，對其結構產生影響。Naimski 等將前人的 DAPI 染色法進行改進，通過優化操作步驟與條件來增加其靈敏度，他們最終優化的結果可使其靈敏度超過EB 熒光染色法[5-6]。

離子對技術應用于 DNA 檢測是其檢測方法學上的一大理論突破。通常應用于 DNA 檢測的染料都帶有銨根離子和芳香環，染料的銨根離子可與 DNA 的磷酸根離子通過靜電作用相互結合，從而實現對 DNA 的染色。此方法不足之處在于銨根離子同時還會與瓊脂糖中的硫酸根離子以及碳酸根離子結合，使得背景顏色較深，從而導致染色結果對比度較差[8,17]。而離子對理論的提出有望改善這一情況，提高靈敏度并降低凝膠背景。離子對檢測技術的原理是通過采用兩種相反電荷的染料，正、負離子染料在溶液中可形成疏水性離子對，使得染色液中游離存在的染料濃度降低，從而提高染料對 DNA 的選擇性，增加 DNA 條帶與背景的對比度，最終提高檢測的靈敏度。同時，離子對染色法不需要脫色步驟，可使檢測時間相對縮減。Choi 等[8,17]將離子對技術運用于 DNA 熒光染色，在增加靈敏度的同時還可避免 EB 的致畸作用。他們將小檗堿（BB）/媒染黃3R（MY3R）離子對染料運用于瓊脂糖上 λDNA/HindIII 的檢測，其靈敏度為 10 ng 左右，雖比 EB 染色方法低兩倍，但比常用的亞甲基藍染色方法高兩倍[18]，兩者染料結構見圖 1、圖 2。

圖 1 Berberine 的化學結構

圖 2 Mordant Yellow 的化學結構

近來人們將花青素類染料大量地應用于各研究領域，如：作為細胞、微團、組織[19-22]的熒光標記和探針、蛋白檢測[23-24]、DNA 測序[25-26]、毛細管和凝膠電泳上核酸的定量分析[27-29]等。Hila 和 Taylor[4]對 23 種花青素染料進行篩選，最終發現了 5 種花青素染料可用于 DNA 檢測，并比EB 染色法具有更高的靈敏度。

在對 DNA 染料進行篩選時，靈敏度是其中一個重要的指標，Schneeberger等[10]采用 SYBR Green I 對 PCR 產物進行檢測，發現其靈敏度與 EB 相比具有較大的提高。同時，Vitzthum 等[9]用 SYBR Green I 對瓊脂糖凝膠上的DNA 進行檢測，結果顯示其靈敏度可達到 20 pg，表明SYBR Green I 在 DNA 定量檢測方面也是一種優良的檢測試劑。另外，用 SYBR Green I 對瓊脂糖凝膠上的 dsDNA進行檢測，通過對體系條件（染料濃度、染色時間、染料與樣品的比例等）的優化，得到最佳熒光強度條件，結果顯示其靈敏度比 EB 高 6 ～ 8 倍，同時證明了 SYBR Green I染料對 dsDNA 有較強的專屬性[9-10]。

SYBR Gold 熒光染料對瓊脂糖凝膠上的 DNA 檢測，可通過三種不同檢測方式進行，包括電泳前染色、電泳與染色同時進行和電泳后染色。Suenaga 和Nakamura[11]將這三種染色方式進行比較，結果顯示電泳前染色所得到的效果比其余兩種方式要好，并且其靈敏度比 EB、SYBR Green I 都要高，但該染料存在著價格昂貴的缺點，并且其染色效果受較多外界因素（例如：染料-DNA 濃度比例、染料-DNA 配對比例等）的影響。

同時，Kirsanov 等[30]研究發現 SYBR Gold 和 SYBR Green II 在 Ames 試驗中不具有變異性，該結果可為未來染料的安全性檢測提供參考。近幾年，SYBR Gold 熒光染料在實時 PCR 的研究中也有較快發展[31]。

2010 年，Huang 等[32]研發的 GelRed 無論是在預制凝膠染色還是在凝膠電泳后染色，都表現出了極高的靈敏度。在凝膠電泳后染色中優于或者至少相當于 SYBR Gold，但與 SYBR Gold 不同，GelRed 在預制凝膠中使用時仍然有極高的靈敏度。

1.2 染料染色法

熒光染色方法雖然具有較高的靈敏度，但其染色后的凝膠需要紫外透射儀進行數據讀取，使得 DNA 染料染色法成為常規實驗選用的檢測技術。常用的 DNA 染料染色法主要有亞甲基藍[33]、亮甲酚藍[34]、乙基紫[35]和尼羅藍[36]等，但是這些染料染色方法或需要較長的脫色時間（約 1 h），或靈敏度較低，或兼具兩個缺點。因此，Yong 等[37]將尼羅藍染色法進行改進，他們通過優化染色的順序（先凝膠電泳，然后再染色），使其靈敏度有很大的提高。雖然該方法與 EB相比，其靈敏度仍較低[34,37]，但因尼羅藍染色方法的低毒性使得它在常規的實驗應用方面具有較好的實用性。

Yang 等[38]將結晶紫（CV）/甲基橙（MO）離子對染料應用于瓊脂糖上的 DNA 檢測：（0.0025% CV，0.0005%MO，pH 6 ～ 7），在 30 min 內即可完成對 3 kb DNA 的檢測，其靈敏度為 8 ng。兩者染料結構見圖 3、圖 4。Hwang等[7]采用吲哚因藍（IB）/甲基橙（MO）離子對染料對瓊脂糖上的 DNA 進行檢測：（0.008% IB、0.002% MO、10% 乙醇、0.2 mol/L 醋酸鈉、pH 4.7），可在 60 min 內完成對λDNA/HindIII 的檢測，其靈敏度可達 5 ng。兩者染料結構見圖 4、圖 5。

1.3 銀染法

銀染法是迄今為止靈敏度最高的一種 DNA 染色法，該染色法廣泛應用于聚丙烯酰胺凝膠上 DNA 的檢測，其基本原理是銀離子與 DNA 分子上的磷酸基團結合，然后結合的銀離子被還原為金屬銀，可使 DNA 呈現深棕色至黑色。銀染后的凝膠還可干燥、保存，但經銀染后的 DNA不能回收，因此這種染色方法只能用于進行 DNA 分析，而不能用于 DNA 的制備與分離[39-40]。

圖 3 結晶紫的化學結構

圖 4 甲基橙的化學結構

圖 5 吲哚因藍的化學結構

近年來，也不斷有人嘗試將銀染法引入到瓊脂糖凝膠上DNA 的檢測，但是實驗結果顯示染色背景太深，較難觀察到 DNA 條帶[18,41]。Gottlieb 和 Chavko[40]將前人的銀染法進行改進，對瓊脂糖凝膠上的真核 DNA 進行檢測，根據不同的樣品采用不同的緩沖液和電泳條件，結果表明該方法檢測真核生物 DNA 的靈敏度比 EB 高，可達 2.5 ng，并且對 5 ～ 30 ng 的單鏈和雙鏈 DNA 均具有很好的線性相關性。

盡管瓊脂糖上 DNA 銀染法具有較高靈敏度，但是其缺點也是非常顯著的，如：①可能造成很高的檢測背景，特別在水不夠純的情況下；②費時費力，操作步驟繁瑣；③費用較高；④需接觸有毒的甲醛[41]等。因此，很多研究人員正不斷尋求安全、靈敏的染色方法來代替銀染法。

1.4 負染法

DNA 分子經過大量化學試劑處理之后，其生物活性往往受到較大影響，為了盡可能地保留核酸的生物活性，Hardy等[16]研發了一種新的檢測方法——鋅咪唑負染法，其靈敏度為 5 ～ 60 ng。該染色法的原理主要是鋅離子與咪唑結合沉淀在膠面上，而在鋅-DNA-咪唑區域不生成沉淀，因此染色后 DNA 條帶區域是透明的。

2 結語及展望

圖 6 近 37 年時間里重要的瓊脂糖凝膠染色方法的時間進程表

表 1 常用的幾種 DNA 檢測方法優缺點的比較

瓊脂糖凝膠上 DNA 染色是核酸分析研究中的一個重要領域，目前其問題主要集中在如何提高染色靈敏度，如何使操作簡捷，如何降低試劑毒性和費用等方面。前人雖經過不懈努力取得一定進展（圖 6），但仍然存在許多有待改進之處（表 1）。例如：①染料染色法雖操作簡單，但其靈敏度還有待提高；②銀染法是目前公認靈敏度較高的染色方法，但它的背景較深，操作步驟繁多，接觸的試劑毒性較大，雖進行了不少改進，但還不盡如人意；③雖然熒光染色法可以使靈敏度接近銀染，但熒光染色往往會改變凝膠中 DNA的性質，給進一步分析造成障礙，而且熒光染色的結果需要紫外透射儀才能夠觀察到；④負染法雖在一定程度上可以克服上述的某些缺點，但負染后膠條與背景的對比度往往不高，且負染后的條帶是透明的，不易進行數據采集。

有效克服以上這些方面的缺陷已成為將來瓊脂糖凝膠上 DNA 檢測的發展方向。例如：如何在保持銀染法高靈敏度的同時，又能夠有效地降低染色背景，同時用無毒的化學物質去代替有毒的物質；針對熒光染色可能造成 DNA的化學性質改變的缺點進行改進；如何在保持負染法不破壞DNA 結構優勢的同時，增加其條帶與背景的對比度等。我們還可以嘗試在染色同時使用幾種染色方法，取長補短，達到最佳檢測效果。上述方面如果能夠得到改善，相信會對DNA 檢測方法的改進帶來極大的影響。

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