醫用自交聯透明質酸鈉凝膠預防兔硬膜外粘連的安全性研究

梁文鍇，郭全義，韓樹峰，張莉，彭江，劉舒云，梁增義，許文靜，盧世璧

硬膜外粘連是椎板切除術后常見的并發癥之一[1]，在預防硬膜外粘連的方法中，除了注意術中操作，以盡量減少出血及其他炎癥反應外，局部應用預防硬膜外粘連材料也得到廣泛關注[2]。

高分子量的透明質酸具有局部抗炎，抑制成纖維細胞分泌細胞外基質等作用[3-4]。因此已被廣泛應用于預防硬膜外粘連，但是普通透明質酸在體內降解過快，遠期預防粘連效果不佳。為克服這一缺點，現將透明質酸分子進行自交聯，使其變成整體的透明質酸團塊，在保留其基本的理化性質的前提下，延長了體內降解時間。雖然交聯后的透明質酸已應用于普外科、婦科等領域的防粘連中，但由于其交聯之后，黏稠度提高，所以將其應用于椎板切除術后預防硬膜外粘連這個特殊領域時，是否會對脊髓的電生理產生影響，其安全性如何，本實驗將進行研究。

1 材料及方法

1.1 材料

1.1.1 材料 醫用自交聯透明質酸鈉凝膠（HyaRegen/SPI）由常州百瑞吉生物醫藥有限公司提供，生產批號：ENT 1002001，常溫避光保存。

1.1.2 實驗動物 健康新西蘭大白兔 24 只，兔齡 4～5 個月，雄性，體重 2.5～3.0 kg。由解放軍總醫院動物實驗中心提供，均飼養于清潔普通環境中。

1.1.3 儀器 體感誘發電位儀購自美國 CADWELL公司。

1.2 方法

1.2.1 手術經過 3% 戊巴比妥鈉靜脈麻醉生效后，剔除兔腰骶部背毛，俯臥位固定于手術操作臺，腰骶部墊高。連接肌電圖儀，分別于兔雙后肢內踝后方皮下刺入刺激電極（遠）和參考電極（近），顱頂部（雙耳連線中點）皮下刺入記錄電極，雙眼連線中點皮下刺入參考電極，腮部皮下刺入地線；連接完畢后予首次電刺激，記錄麻醉后體感誘發電位（CSEP）潛伏期值。術區碘伏消毒后鋪單，以 L5棘突為中心做腰骶部正中切口，切口長度約 3 cm，暴露椎旁肌，鈍性剝離椎旁肌，暴露出 L5 椎板。用電磨鉆行 L5 椎板切除術，形成 5 mm × 8 mm硬脊膜暴露區，生理鹽水術區沖洗，出血處壓迫止血。此時行第 2 次電刺激，記錄椎板切除術后CSEP 潛伏期值。

剔除因手術操作損傷脊髓而導致 CSEP 異常的兔子，剩下的兔子按照處理方法不同隨機分為A、B、C、D 四組，A組（對照組）術區僅用生理鹽水沖洗；B組、C組、D組均為實驗組：于硬脊膜暴露區覆蓋醫用自交聯透明質酸鈉凝膠，但劑量各不相同，分別為 0.5、0.75 和1.0 ml。動物在逐層閉合切口后，蘇醒前行第 3 次電刺激，記錄 CSEP 潛伏期值。術后動物允許籠中自由活動，單籠單兔，飼養條件同術前。

1.2.2 觀察指標

1.2.2.1 體感誘發電位測定 各電極刺入體表位置如前所述，參數設定：持續刺激電極的頻率2.7 Hz，持續時間 200 ms；方波刺激脛神經，刺激強度以略引起腓腸肌顫動為宜，信號疊加 200 次；過濾信號頻率：2～2000 Hz。每只動物均進行 4 次CSEP 潛伏期值測定：除了上述 3 次測定外，動物在術后第 8 周在同前麻醉條件下行第 4 次 CSEP潛伏期值測定，觀察各組潛伏期值的變化。

1.2.2.2 對后肢運動情況進行評分 分別在術前、術后第 1 天及術后第 8 周對兔的后肢進行運動功能評分。采用 Tarlov 評分標準[5]：0 分：肢體完全癱瘓；1 分：后肢可水平劃動；2 分：后肢可以活動但不能負重；3 分：后肢可負重和行走，但不穩；4 分：正常。

1.3 統計學處理

2 結果

動物均在術后約 40 min 內清醒，自主飲水進食。觀察期間無動物死亡。手術切口未見感染、切口愈合時間約為 7 d。

2.1 體感誘發電位

4 次 CSEP 測定 A、B、C、D 四組的潛伏期值詳見表 1，結果顯示：麻醉生效后首次 CSEP 測定，各組潛伏期值差異無統計學意義（P ＞ 0.05）（圖 1）；行 L5 椎板切除術將硬脊膜完全暴露后的第 2 次 CSEP 測定顯示，各組潛伏期值均略有延長，但延長值均小于 10%，且各組間差異無統計學意義（P ＞ 0.05）（圖 2）；各組在完成不同處理關閉切口之后的第 3 次 CSEP 測定顯示，A組（對照組）與 B組（0.5 ml組）潛伏期值均無明顯延長，且兩組之間差異無統計學意義（P ＞ 0.05），而 C組（0.75 ml組）和D組（1.0 ml組）的潛伏期值較前延長，且與 A組和B組相比，差異具有統計學意義（P ＜ 0.05）（圖 3）；術后 8 周在相同麻醉條件下復測各組動物 CSEP 潛伏期值顯示：各組CSEP 潛伏期值均處于正常值范圍（C組和D組潛伏期值回歸至正常范圍），且各組間差異無統計學意義（P ＞ 0.05）（圖 4）。

2.2 運動功能評分

術前各組動物運動功能評分（Tarlov 標準）均為 4 分；在術后第 1 天再次對各組動物進行運動功能評分后發現：A組（對照組）和B組（0.5 ml組）運動功能評分同術前，但C組（0.75 ml組）和D組（1.0 ml組）其運動功能評分均有不同程度的下降；在術后 8 周再次對各組動物運動功能進行評分后發現：其評分結果均為正常（表 2）。

表1 4 次 CSEP 測定 A、B、C、D 四組潛伏期值（n = 6）Table 1 Four time points of CSEP, the latency of group A, B, C, D (n = 6)

圖1 首次 CSEP 測定（麻醉生效后）：左側兩條波形為 A組（對照組）刺激動物雙脛后神經形成的 CSEP 波形；右側從上至下分別為：B組（上兩條）、C組（中間兩條）、D組（下兩條）刺激動物雙脛后神經形成的 CSEP 波形。測定各組潛伏期值（P1）差異無統計學意義（P ＞ 0.05）Figure 1 CSEP was monitored in the first time (after anesthesia): the two waves on the left side were produced by stimulating bilateral posterior tibial nerves of animals in group A.The waves on the right side from up to down were produced by stimulating bilateral posterior tibial nerves of animals in group B (the upper two), group C (the middle two) and group D (the lower two)respectively.There were no significant difference of the latency (P1) between each group (P ＞ 0.05).

圖2 行 L5 椎板切除術將硬脊膜完全暴露后的第 2 次 CSEP 測定：各組潛伏期值（P1）均略有延長，但延長值均小于10%。左側兩條波形為 A組（對照組）刺激動物雙脛后神經形成的 CSEP 波形；右側從上至下分別為：B組（上兩條）、C組（中間兩條）、D組（下兩條）刺激動物雙脛后神經形成的 CSEP 波形。測定各組潛伏期值（P1）差異無統計學意義（P ＞ 0.05）Figure 2 CSEP were monitored in the second time (after laminectomy): the latency (P1) of each group were all delayed slightly,but the value of prolongation were all under 10%.The two waves on the left side were produced by stimulating bilateral posterior tibial nerves of animals in group A.The waves on the right side from up to down were produced by stimulating bilateral posterior tibial nerves of animals in group B (the upper two), group C (the middle two) and group D (the lower two) respectively.There were no significant difference of the latency (P1) between each group (P ＞ 0.05).

3 討論

圖3 各組在完成不同處理關閉切口之后的第 3 次 CSEP 測定：A組（左側兩條波形）與 B組（右側上兩條波形）潛伏期值（P1）均無延長（P ＞ 0.05），C組（右側中間兩條波形）和D組（右側下兩條波形）的潛伏期值均延長，且與 A組（對照組）和B組相比，差異具有統計學意義（P ＜ 0.05）Figure 3 CSEP were monitored in the third time (after wound closure): The waves of CSEP of group A (the two waves on the left side) and group B (the upper two waves on the right side) showed that the latency (P1) were not delayed in that two groups (P ＞0.05).In group C (the middle two waves on the right side) and group D (the lower two waves on the right side), however, the latency(P1) were delayed significantly compared with that of group A and group B (P ＜ 0.05).

圖4 第 4 次測定各組動物 CSEP（術后 8 周）：各組潛伏期值（P1）均在正常值范圍內（P ＞ 0.05）。左側兩條波形為 A組（對照組）刺激動物雙脛后神經形成的 CSEP 波形；右側從上至下分別為：B組（上兩條）、C組（中間兩條）、D組（下兩條）刺激動物雙脛后神經形成的 CSEP 波形Figure 4 CSEP were monitored in the fourth time (at post-surgery 8 weeks): the latency (P1) of each group were all in the normal range (P ＞ 0.05).The two waves on the left side were produced by stimulating bilateral posterior tibial nerves of animals in group A.The waves on the right side from up to down were produced by stimulating bilateral posterior tibial nerves of animals in group B (the upper two), group C (the middle two) and group D (the lower two) respectively.

表2 各組動物三次運動功能評分結果（n = 6）Table 2 The results of three times of motor scoring of each group (n = 6)

硬膜外粘連是發生腰椎手術失敗綜合征（failed back surgery syndrome）的重要原因之一[6]。因此多種生物材料被應用于粘連的預防當中，透明質酸就是其中的一種。然而普通的透明質酸在體內降解速度較快，遠期預防粘連效果欠佳，為克服這一缺點，各學者或將透明質酸制成膜[7]，或與其他自體組織聯合應用[8]，以延長體內降解時間。本實驗中所應用的醫用自交聯透明質酸鈉凝膠是將普通透明質酸分子自交聯，從而延長其體內降解時間。但較高的自交聯程度導致了該生物材料黏稠度的提高，因此將其應用于椎板切除術后預防硬膜外粘連這個特殊領域時，是否會對脊髓的電生理產生影響，其安全性值得研究。

CSEP 是測定脊髓損傷的敏感指標[9]。Su 等[10]通過運用 CSEP 來檢測硬膜外局部用藥的安全性，同理，本實驗也采用 CSEP 來測定不同劑量的HyaRegen/SPI 對脊髓電生理功能的影響。CSEP 運用在術中監控，若潛伏期延長 10% 以上，或波幅下降 50%，則為報警閾值[11]。因此本實驗采用術中CSEP 監控，能及時剔除手術操作損傷脊髓的兔子，保證了實驗數據的客觀性和準確性。根據文獻[12-13]報道，CSEP 波幅的變化差異和變異較大，而 CSEP 潛伏期值更為敏感和可靠，本實驗過程中也同樣發現，在相同麻醉條件下時，未行任何手術操作時，各組動物的 CSEP 波幅就已表現的極為不穩定，而潛伏期值則較為穩定，因此本實驗中主要以 CSEP 潛伏期值作為觀察指標。本實驗研究發現：行椎板切除術暴露出硬脊膜之后，即刻 CSEP潛伏期值在各組均略有延長，但均小于 10%，因此并不考慮為手術損傷，考慮為溫度較低的生理鹽水沖洗術區所致，且在對照組（A組）和HyaRegen/SPI 0.5 ml組（B組）閉合切口之后，均恢復至正常值，這與徐印坎等[11]的研究一致。

各組完成不同的處理之后逐層關閉切口，測各組 CSEP，結果顯示：A組（對照組）和B組（覆蓋 HyaRegen/SPI 0.5 ml）的潛伏期值無延長（P ＞0.05），但是C組（覆蓋 HyaRegen/SPI 0.75 ml）和D組（覆蓋 HyaRegen/SPI 1.0 ml）的潛伏期值出現延長（P ＜ 0.05），結合次日運動功能評分結果（A組、B組正常，而 C組、D組評分下降），說明 C組和D組動物的脊髓受到了壓迫，但產生這種壓迫作用的原因可能有 3 種：①肌層的閉合會使肌層與暴露出的硬脊膜之間的空間縫隙變小，而透明質酸鈉凝膠正是位于這個空間縫隙內。若透明質酸鈉凝膠的劑量偏大，則其體積也相應增大，在肌層與硬脊膜之間的狹小空間內就會受到擠壓力，在這種擠壓力作用下，透明質酸鈉凝膠突向較柔軟的脊髓組織，從而對其產生壓迫作用。若手術切口長度加大，軟組織剝離范圍加大，椎板切除面積也加大，則肌層與暴露出的硬脊膜之間的空間縫隙就會相應增大，那么脊髓可承受的透明質酸鈉凝膠的劑量也就相應增大，但它們之間的具體關系仍需進一步實驗證明。②本實驗選用新西蘭兔作為實驗動物，在這種四足行走的動物中，透明質酸鈉凝膠的重力方向與動物脊髓呈垂直關系，若透明質酸鈉凝膠的劑量偏大，則質量增大，垂直壓迫脊髓的重力也相應增大，因此產生壓迫作用。但在雙足直立行走的動物（如：人），透明質酸鈉凝膠的重力方向與動物脊髓呈平行關系，則有可能不會對脊髓產生壓迫，對此仍需進一步實驗證明。③是上述兩種作用力的綜合作用。

在術后 8 周復測 CSEP 及運動評分發現：各組 CSEP 潛伏期值均處于正常值范圍（P ＞ 0.05）；運動評分也均正常。此時考慮 0.75 ml組（C組）和1.0 ml組（D組）的透明質酸凝膠已被代謝，局部壓迫解除，使脊髓電生理功能及運動功能恢復正常。

通過該實驗我們認為：對于該實驗模型，0.5 ml的醫用自交聯透明質酸鈉凝膠是一個安全劑量，局部應用之后不會對脊髓造成壓迫，不會影響其電生理功能及后肢運動功能，而 0.75 ml 和1.0 ml 的局部用藥劑量偏大，會對脊髓產生壓迫，因此不推薦使用該劑量進行下一步的實驗。但0.5 ml 的醫用自交聯透明質酸鈉凝膠是否能夠有效地預防椎板切除術后硬膜外粘連，則需進一步實驗研究。同時本實驗也提示我們：任何應用于脊髓硬膜外的植入材料，在考慮其生物相容性、毒性作用[10]的同時，必須同時要考慮在此特殊部位，植入材料的物理特性對局部組織的危害。但至于這種物理特性產生局部組織危害的機制及它們之間的具體關系則需進一步研究。在實際的科學研究中，藥物或器械的化學毒性是藥物或器械研發人員最關心的，而臨床醫師的關心點在于藥物或器械對局部微環境的影響及操作使用的可行性，因此只有科研和臨床的結合才會出現具有臨床應用價值的產品。因此綜上所述，若想要將該透明質酸鈉凝膠應用于人體，其應用劑量及安全性問題則需要更多的動物實驗甚至臨床實驗進行研究。

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