羅布泊來源脹果甘草根際枯草芽孢桿菌GA21次生代謝產物結構與活性初步研究

靳婧，旭格拉·哈布丁，劉少偉，郭琳，蔣忠科，欒迎春，李展先，潘臻，孫承航

特殊生態環境，尤其是極端環境是發現新微生物資源及新活性分子的寶庫，近年來對這一寶庫的資源勘探和新活性分子的發掘，在國際上已成為新的研究熱點[1-3]，針對這一研究熱點，我們對來源于有地球“旱極”之稱的羅布泊[4]及周邊地區的微生物藥用資源開展了勘探和藥物篩選的研究工作，其中在以水稻稻瘟菌為檢定菌，對沙生植物脹果甘草根際土壤分離出的一批放線菌和芽孢桿菌進行活性篩選過程中發現，枯草芽孢桿菌 GA21 的發酵液具有較強抗真菌活性。本文報道了枯草芽孢桿菌GA21 的培養，GA21-20 和GA21-26 的分離純化，GA21-20 的譜學數據以及新化合物 GA21-26的抗真菌活性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 菌株 GA21 經 16S rRNA 測序及NCBI 數據庫 BLAST 比對表明 GA21 與菌株Bacillus Subtilis strain 47-B-41 核糖體堿基序列相似性為 100%，鑒定為枯草芽孢桿菌。

1.1.2 植物病原真菌 水稻稻瘟菌（Pyricularia oryzae）由浙江省農業科學院夏湛恩研究員饋贈。

1.1.3 培養基 GA21 的斜面、種子和發酵培養基均為改良高氏一號培養基（可溶性淀粉 20 g，氯化鈉 50 g，磷酸氫二鉀 0.5 g，硝酸鉀 1 g，硫酸鎂 1 g，硫酸亞鐵 0.02 g，葡萄糖 1 g，蛋白胨 0.5 g，胰蛋白胨 0.3 g，蒸餾水 1000 ml，10% 無水碳酸鈉調 pH 8.0）。

水稻稻瘟菌培養基 馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（PDA 培養基）由廣東環凱生物科技有限公司提供。

白色念珠菌培養基 沙堡培養基（SDA 培養基）（麥芽糖 40 g，蛋白胨 20 g，瓊脂 20 g，蒸餾水 1000 ml，調 pH 6.0）。

大腸桿菌培養基、金黃色葡萄球菌培養基均為LB 培養基（酵母提取物 5 g，蛋白胨 10 g，NaCl 5 g，蒸餾水 1000 ml，調 pH 7.5）。

1.1.4 試劑 分析純乙酸乙酯、甲醇等均為北京化工廠生產；色譜級甲醇購于美國 Honeywell Burdick & Jackson 公司；水為屈臣氏蒸餾水。

1.1.5 分離填料 TLC 板、Silica gel 60 F254 鋁箔板及玻璃板為德國 Merck 公司產品；高效液相色譜半制備柱 Zorbax SB-C18（9.4 mm × 250 mm，5 μm）和高效液相色譜分析柱 Zorbax SB-C18（9.4 mm × 150 mm，5 μm）均為美國安捷倫公司產品。

1.1.6 儀器 高效液相色譜儀 Agilent 1200 series為美國安捷倫公司產品；Linomat 5 TLC 板半自動點樣儀為瑞士卡瑪公司產品；Varian VNS-600 核磁共振分析儀為瑞士瓦里安公司產品；Christ RVC 2-18 型離心濃縮機為德國 Christ 公司產品。

1.2 方法

1.2.1 GA21 菌株的發酵 將生長良好的菌株GA21 斜面接種至含 50 ml 種子培養基的 250 ml三角瓶中，置于 28 ℃、180 r/min 搖床上旋轉振蕩培養 24 h，然后轉接于含 1000 ml 發酵培養基的5000 ml 三角瓶中，28 ℃、180 r/min 搖床上旋轉振蕩培養 48 h，收獲發酵液。

1.2.2 活性檢測方法

⑴以稻瘟菌為檢定菌，其斜面培養基為 PDA瓊脂培養基，培養條件為 28 ℃，培養 4 d。用接種環刮取菌苔并轉移至消毒后的磨菌器，磨菌器中加入 2 ml 生理鹽水，磨菌后獲得的稻瘟菌懸液以1% 接種量轉移至約 40 ℃ 的 PDA 瓊脂培養基中，混勻后，以 10 ml/皿迅速分裝于已鋪有 10 ml PDA 瓊脂培養基的 90 mm 培養皿中，凝固后，將浸有已風干待測樣品的 6 mm 圓形紙片貼于檢定平板上，置于 28 ℃ 恒溫培養箱中培養 4 d，觀察結果。

⑵以白色念珠菌為檢定菌，其培養基為 SDA培養基，培養條件為：28 ℃，培養 12 h。用接種環在白色念珠菌斜面培養基上刮取少量菌苔到SDA 液體培養基中，白色念珠菌液以 5% 接種量轉移至約 40 ℃ 左右的 SDA 培養基中，混勻后，以 10 ml/皿迅速分裝于已鋪有 10 ml SDA 培養基的 90 mm 培養皿中，凝固后，將浸有已風干待測樣品的 6 mm 圓形紙片貼于檢定平板上，置于 28 ℃恒溫培養箱中培養 12 h，觀察結果。

⑶以金黃色葡萄球菌，大腸桿菌為檢定菌，培養基均為 LB 培養基，培養條件和活性測定方法同上。

1.2.3 GA21-20 和GA21-26 的分離純化 GA21菌株發酵液（10 L）經 4000 r/min 離心 15 min，獲得發酵產物上清液，以等體積乙酸乙酯萃取上清液，萃取液經無水硫酸鈉脫水，減壓濃縮，獲得粗品。粗品用半自動點樣儀點樣于硅膠板（10 cm ×10 cm），氯仿∶甲醇 = 4∶1 展開，200 μl/板 × 27 板。取其中一塊點樣展開后的硅膠鋁箔板，按展開方向切下 8 mm 左右條帶，在稻瘟菌平板上測活，根據活性點的比移值，在紫外燈下將其余展開后的制備薄層板上同樣比移值的條帶刮下，并裝于小玻璃柱（15 cm × 1.5 cm），用適當體積的甲醇進行洗脫，將洗脫液減壓濃縮，濃縮后，用少量甲醇溶解，經0.22 μm 過濾膜過濾后的樣品，進一步用反相半制備高效液相柱純化，制備條件如下：流動相為 55%甲醇水溶液，流速為 2 ml/min，檢測波長 254 nm，收集保留時間為 19.8 min 的 GA21-20 和26.6 min的 GA21-26，離心濃縮除去甲醇和水。對樣品純度進行高效液相色譜分析，分析條件如下：流動相為51% 甲醇水溶液，流速為 1 ml/min，檢測波長為254 nm。GA21-20 保留時間 7.1 min 純度為 99%，GA21-26 保留時間為 10.4 min，純度為 99%。

2 結果

2.1 化合物 GA21-20 和GA21-26 的結構鑒定

以甲醇為溶劑，化合物 GA21-20 和GA21-26紫外吸收光譜均在 248 nm 和312 nm 有最大紫外吸收，推測可能為 3, 4-二氫異香豆素類化合物[5]，GA21-20 的高分辨質譜見圖 1。HR- ESIMS：[M+H]+實測值為 425.19292，理論值為 425.19184，分子式為 C20H28O8N2，不飽和度 ? = 8。由GA21-20 的13C-NMR 和DEPT 譜可知該化合物含 6 個季碳，9 個叔碳，3 個仲碳，2 個伯碳，結合1H-NMR、13C-NMR 中的化學位移和1H-1H COSY、13C-1H COSY 可知 GA21-20 有 2 個甲基碳信號，3 個羰基碳信號，其中一個為酯羰基碳信號：1-C（δ = 169.0）、1 個酰胺羰基碳信號 7′-C（δ = 172.7）和1 個羧酸羰基碳信號 12′-C（δ =173.4）。由1H -1H COSY 觀察到 5-H（δ = 6.808，1H，d）與 6-H（δ = 7.472，1H，t）相關，7-H（δ = 6.839，1H，d）亦與 6-H 相關，再結合 HMBC譜，5-H 信號與 7-C（δ = 115.2）和8a-C（δ = 108.2）相關，6-H 信號與 4a-C（δ = 140.6）和8-C（δ =160.8）相關，從而可推斷出結構式中含有的苯酚結構；1H-1H COSY 譜表明 4′-H（δ = 2.120，1H，t 與δ = 1.326，1H，t）與 5′ -H（δ = 4.193，1H，t）、5′-H與 3-H（δ = 4.672，1H，dt），3-H 與 4-H（δ = 3.044，1H，t 和δ = 2.848，1H，d）相關；3′-H（δ = 1.650，1H，m）與 1′-H（δ = 0.831，3H，d）和2′-H（δ =0.906，3H，d）分別相關；結合 HMBC 可推出與苯環相連的部分結構片段；此外，在1H-1H COSY譜中，出現了 8′-H（δ = 3.615，1H，d）和9′-H（δ = 3.908，1H，q），9′-H 和10′-H（δ = 3.125，1H，t），10′-H 和11′-H（δ = 2.299，1H，d 和δ =2.255，1H，d）相關，結合 HMBC，9′-H 與 7′-C（δ = 172.7），10′-H 與 8′-C（δ = 72.7）相關，從而推出了與 3, 4 -二氫異香豆素母核相連的側鏈基團片段。綜合上述結構特征以及 1D-NMR 和2D-NMR 的仔細解析，并與文獻[6]比較，確定了GA21-20 化學結構與 Amicoumacin B 一致，結構如圖 2 所示。GA21-20 的13C 和1H 信號歸屬如表 1。

圖1 GA21-20 高分辨質譜圖Figure 1 HR-ESIMS of GA21-20

圖2 GA21-20 化學結構Figure 2 Chemical structure of GA21-20

表1 GA21-20 的氫譜數據及其碳譜數據Table 1 1 H-NMR and 13C-NMR data of GA21-20

圖3 GA21-26 高分辨質譜圖Figure 3 HR-ESIMS of GA21-26

表2 不同濃度 GA21-26 對白色念珠菌和稻瘟菌抑菌圈的直徑（mm）Table 2 Inhibitory zone diameter of compounds GA21-26 against Canidia albicans and Py ricularia oryzae (mm)

化合物 GA21-26 的紫外吸收峰與 GA21-20一致，高分辨質譜見圖 3。HR-ESIMS：[M+H]+實測值為 436.20890；理論值為 436.20783，分子式為 C21H29O7N3，不飽和度 ? = 9，目前文獻報道的Amicoumacin 類似物中并沒有此分子量，因此其為一新的 Amicoumacin 族化合物，GA21-26 的核磁共振數據亦支持這一結論，新化合物 GA21-26 的化學結構、結構解析、理化性質將另文報道。

2.2 GA21 菌株發酵液粗品抗細菌及抗真菌活性

GA21 菌株發酵液粗品 50 ml，經 4000 r/min離心 15 min，獲得發酵產物上清液，以等體積乙酸乙酯萃取上清液，減壓濃縮，獲得粗品。用 1 ml 甲醇溶解樣品，取 60 μl 溶解后的樣品分別加到直徑為 6 mm 的紙片上，待紙片揮干溶劑后貼于金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、稻瘟菌、白色念珠菌測活平板上。觀察結果表明，發酵液乙酸乙酯萃取物對稻瘟菌、白色念珠菌具有抑制活性，對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌無抑制活性。

2.3 化合物 GA21-20 和GA21-26 的抗真菌活性

采用倍半稀釋法使化合物 GA21-20 和GA21-26 在直徑為 6 mm 的紙片上濃度分別為80、40、20、10、5、2.5、1.25、0 μg。待紙片揮干溶劑后貼于白色念珠菌、稻瘟菌平板上，觀察抑菌圈直徑，結果如表 2 所示。GA21-26 在 2.5 μg/紙片對白色念珠菌即可顯示抑制活性，但在 80 μg/紙片才對水稻稻瘟菌顯示抑制活性，表明 GA21-26在拮抗醫學條件致病真菌方面有潛在用途。GA21-20對白色念珠菌和稻瘟菌均無抑制活性。

3 討論

枯草芽孢桿菌屬微生物可產生包括肽類、酯肽類、磷脂類、聚酮類、氨基糖類等[7]超過 20 種不同結構類型的抗生素[8]，但大部分為肽類抗生素，其中包括核糖體途徑合成的肽類抗生素如枯草菌素（subtilin）、Ericin 和Mersacidin 等以及非核糖體途徑合成的酯肽類抗生素如表面活性素（surfactin）、伊枯草菌素（iturin）、豐原素（fengycin）等；同時，該屬微生物還能產生一些非肽類抗生素[9]，如聚酮類（polyketides）、萜類、異香豆素類抗生素等。異香豆素類具有廣泛的生物活性，如抗細菌、抗病毒、抗炎、抗腫瘤、胃腸保護等，目前以微生物 Streptoverticillium eurocidicum 次生代謝產物 cytogenin 為模板，經結構修飾的 NM-3 作為口服治療非小細胞肺癌藥物已進入二期臨床試驗，有望開發成新的抗腫瘤血管生成抑制劑類藥物[10-12]，可見異香豆素類化合物具有較好潛在的成藥性。本研究發現的 GA21-20 和GA21-26 屬于異香豆素類抗生素中具有 3, 4-二氫異香豆素母核的Amicoumacin，Amicoumacin 類抗生素 Amicoumacin A, B, C 最早由 Itoh 等[13]在 1981 年報道，其母核為 3, 4-二氫異香豆素，并在 3 位上固定連接甲基丁基氨基側鏈，隨氨基側鏈基團變化，衍生出許多Amicoumacin 類似物。對已發現 Amicoumacins 類化合物及結構類似物的文獻調研表明，該類化合物主要來源于芽孢桿菌和真菌，少量來源于致病桿菌屬、放線菌屬等，目前文獻報道的微生物來源Amicoumacin 及其類似物有 16 種。在實驗中發現，GA21 菌株除了能產生 GA21-20（Amicoumacin B）及 GA21-26 兩個化合物外，還能產生許多紫外吸收與之類似的小組分，如果通過 LC-MS 分析方法，在比對分子量的基礎上定向發現并進一步純化該類新組分，開展生物活性研究，有望能進一步從該菌株的次生代謝產物中發現新的異香豆素類先導化合物。

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