Snail在乳腺癌中的表達及其與上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的關(guān)系

劉志容，吳誠義

上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）是上皮細胞在與細胞外因子相互作用過程中因喪失極性及細胞間緊密連接而獲得移行和游走能力，轉(zhuǎn)化為具有間質(zhì)特性細胞的過程。它不僅是多細胞生物胚胎發(fā)育的基礎(chǔ)過程，更與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展和侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[1-3]。同樣借助 EMT 方式，乳腺癌惡性腫瘤細胞的遷移和運動能力亦可明顯增強，從而促進腫瘤的發(fā)展與侵襲轉(zhuǎn)移。為此，本研究通過檢測細胞表面 EMT 相關(guān)標記物 E-cadherin、Vimentin 及其調(diào)控因子Snail 在正常乳腺組織、乳腺癌癌旁組織及乳腺癌組織的表達情況，以探討 Snail 蛋白及其調(diào)控的EMT 與乳腺癌發(fā)生發(fā)展及遠處轉(zhuǎn)移的相關(guān)性，以及 Snail 蛋白作為乳腺癌治療關(guān)鍵靶點的潛在意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標本來源 正常乳腺組織取自本院內(nèi)分泌乳腺外科 2010 年 5 – 6 月 20 例女性乳腺良性病變患者微創(chuàng)手術(shù)的切緣標本。患者年齡 20～50 歲，平均 35 歲。

乳腺癌組織及乳腺癌癌旁組織取自本院內(nèi)分泌乳腺外科 2010 年 1 – 6 月 60 例女性乳腺癌患者改良根治術(shù)的切除標本，并經(jīng)常規(guī)病理學檢查證實均為非特殊性浸潤性導管癌；60 例患者中20 例同時取癌組織邊緣 2～5 cm 的癌旁組織。患者年齡 34～84 歲，平均 54 歲。

1.1.2 主要試劑 兔抗人 Snail、E-cadherin、Vimentin 多克隆抗體及生物素標記的羊抗兔 IgG抗體均購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；鏈霉素親和素-過氧化酶復合物法（SP）免疫組織化學試劑盒、二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 標記蛋白表達的檢測 手術(shù)切除標本離體后均立即取材，經(jīng) 4% 甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，制成 5 μm 厚連續(xù)切片 4 張，其中 1 張用于 HE染色復核病理診斷，其余 3 張分別用于 Snail、E-cadherin、Vimentin 免疫組織化學 SP 法染色。Snail 與 E-cadherin 抗體工作液濃度均為 1∶50，Vimentin 抗體工作液濃度為 1∶100，二抗為生物素標記的羊抗兔 IgG 抗體。按試劑盒說明書操作步驟進行染色，石蠟包埋切片經(jīng)二甲苯脫蠟及梯度乙醇逐步水化后，采用 0.01 mmol/L 的枸櫞酸緩沖液高溫抗原熱修復 15 min，冷卻至室溫。3% H2O2浸泡 10 min，山羊血清孵育 30 min，依次滴加一抗4 ℃ 過夜，二抗 37 ℃ 放置 30 min，滴加 SP，37 ℃ 放置 30 min，DAB 顯色，蘇木精復染，脫水封片。PBS 代替一抗作陰性對照，均以已知陽性組織切片作為陽性對照。

1.2.2 結(jié)果判斷 每張切片在高倍鏡下（× 400）隨機選取 5 個視野，鏡下觀察細胞的染色強度和廣度（即陽性細胞比例）。

1.2.2.1 Snail 蛋白 以細胞質(zhì)或細胞核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色染色顆粒為 Snail 蛋白表達陽性。染色強度評分：0 分，無染色；1 分，弱陽性；2 分，強陽性。染色廣度評分：1 分，1%～25 %；2 分，26%～50%；3 分，51%～75%；4 分，76%～100%。根據(jù)染色強度和廣度的乘積判定各標本積分，積分分級：1～2 分為陰性；3～8 分為陽性[4]。

1.2.2.2 E-cadherin、Vimentin 蛋白 以細胞膜或細胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色染色顆粒為 E-cadherin 蛋白表達陽性，以細胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色染色顆粒為Vimentin 蛋白表達陽性。E-cadherin 蛋白表達陽性染色廣度評分：≤ 90% 判定為 E-cadherin 蛋白表達降低；＞ 90% 判定為 E-cadherin 蛋白表達保留。Vimentin 蛋白表達陽性染色廣度評分：≤ 20% 判定為 Vimentin 蛋白低表達；＞ 20% 判定為Vimentin 蛋白高表達[5]。

1.3 統(tǒng)計學分析

采用 SPSS17.0 統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)處理。組間實驗檢測數(shù)據(jù)的比較采用 χ2檢驗，相關(guān)性研究采用 Spearman 等級相關(guān)分析，以 P ＜ 0.05 為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 Snail 蛋白表達

鏡下觀察可見 Snail 蛋白主要定位表達于細胞的細胞質(zhì)內(nèi)，也可見于部分細胞的細胞核，呈棕黃色染色顆粒。Snail 蛋白在正常乳腺組織、乳腺癌癌旁組織、乳腺癌組織中表達的陽性率分別為0、30.0%、53.3%，并隨著乳腺組織癌變的發(fā)展而逐漸遞增；3 種組織中 Snail 蛋白的表達差異具有統(tǒng)計學意義（χ2= 18.789，P = 0.000）（表 1、圖 1）。

2.2 Vimentin 和E-cadherin 蛋白表達

鏡下觀察可見 Vimentin 蛋白在正常乳腺組織中不表達，其主要定位表達于腫瘤細胞的細胞質(zhì)內(nèi)，呈棕黃色染色顆粒。Vimentin 蛋白在正常乳腺組織、乳腺癌癌旁組織、乳腺癌組織中表達的陽性率分別為 0、40.0%、63.3%，且隨著乳腺組織癌變的發(fā)展，Vimentin 表達亦逐漸增強；3 種組織中 Vimentin 蛋白的表達差異具有顯著統(tǒng)計學意義（χ2= 24.584、P = 0.000）（表 2、圖 2）。

表1 Snail 蛋白在乳腺癌組織中的表達Table 1 Expression of Snail protein in breast cancer tissues

圖1 乳腺癌組織中 Snail 蛋白表達的免疫組織化學檢測（A：正常乳腺組織中 Snail 蛋白呈陰性表達 SP × 400；B：乳腺癌癌旁組織中 Snail 蛋白呈弱陽性表達 SP × 400；C：乳腺癌組織中 Snail 蛋白呈強陽性表達 SP × 200）Figure 1 Immunohistochemical detection of the expression of Snail protein in breast cancer tissues.A: The negative expression of Snail protein in normal breast tissue (SP × 400); B: The weakly positive expression of Snail protein in adjacent tissue of breast cancer(SP × 400); C: The strongly positive expression of Snail protein in breast cancer tissue (SP × 200)

鏡下觀察可見 E-cadherin 蛋白主要定位表達于細胞的細胞膜或細胞質(zhì)內(nèi)，呈棕褐色染色顆粒。E-cadherin 蛋白在正常乳腺組織、乳腺癌癌旁組織和乳腺癌組織中表達的陽性率分別為 100.0%、75.0%、56.7%，且隨著乳腺組織的癌變及轉(zhuǎn)移，E-cadherin 蛋白表達逐漸減少，而其在乳腺癌細胞內(nèi)的表達部位也隨之發(fā)生相應(yīng)改變，表現(xiàn)為主要定位表達于細胞質(zhì)，而細胞膜則不明顯；3 種組織中E-cadherin 蛋白的表達差異具有統(tǒng)計學意義（χ2=13.589、P = 0.001）（表 2、圖 2）。

2.3 Snail 和E-cadherin、Vimentin 表達的相關(guān)性

隨著正常乳腺組織癌變的發(fā)展，Snail 蛋白表達逐漸增強，Vimentin 蛋白表達也逐漸上調(diào)，而E-cadherin 蛋白表達則呈減少趨勢。Spearman 等級相關(guān)分析表明：① Snail 蛋白表達與 E-cadherin 蛋白表達呈負相關(guān)（r = –0.413、P = 0.001）；② Snail 蛋白表達與 Vimentin 蛋白表達呈顯著正相關(guān)（r =0.536、P = 0.000）；③在 3 種組織中，隨著上皮標記物 E-cadherin 蛋白表達的降低，間質(zhì)標記物Vimentin 蛋白表達逐漸增高，兩者的表達差異呈顯著負相關(guān)（r = –0.526、P = 0.000，表 3）。

表2 E-cadherin、Vimentin 蛋白在乳腺癌組織中的表達Table 2 Expression of E-cadherin and Vimentin protein in breast cancer tissues

圖2 乳腺癌組織中 E-cadherin、Vimentin 蛋白表達的免疫組織化學檢測 SP × 400（A：正常乳腺組織中 Vimentin 蛋白呈陰性表達；B：乳腺癌癌旁組織中 Vimentin 蛋白呈弱陽性表達；C：乳腺癌組織中 Vimentin 蛋白呈強陽性表達；D：正常乳腺組織中 E-cadherin 蛋白呈強陽性表達；E：乳腺癌癌旁組織中 E-cadherin 蛋白呈弱陽性表達；F：乳腺癌組織中E-cadherin 蛋白呈極弱陽性表達）Figure 2 Immunohistochemical detection of the expression of E-cadherin and Vimentin protein in breast cancer tissues (SP × 400).A: The negative expression of Vimentin protein in normal breast tissue; B: The weakly positive expression of Vimentin protein in adjacent tissue of breast cancer; C: The strongly positive expression of Vimentin protein in breast cancer tissue; D: The strongly positive expression of E-cadherin protein in normal breast tissues; E: The weakly positive expression of E-cadherin protein in adjacent tissue of breast cancer; F: The very weakly positive expression of E-cadherin protein in breast cancer tissue

表3 乳腺癌組織中 Snail 與 E-cadherin、Vimentin 蛋白表達強度的 Spearman 相關(guān)分析Table 3 The Spearman correlation analysis among expression intensity of Snail, E-cadherin and Vimentin protein in breast cancer tissues

表4 Snail 蛋白表達與乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的相關(guān)性Table 4 The Spearman correlation analysis between expression of Snail protein and lymph node metastasis in breast cancer tissues

2.4 Snail 蛋白表達和乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的相關(guān)性

在 60 例乳腺癌組織標本中，其中 32 例Snail 蛋白表達陽性，Snail 蛋白表達陽性率為53.3%（32/60）。在 32 例 Snail 蛋白表達陽性的乳腺癌組織標本中，28 例伴有腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（87.5%，28/32），4 例未見淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移；而在 28 例Snail 蛋白表達陰性的乳腺癌組織標本中，僅有 8

例伴有腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（28.6%，8/28）。Spearman 等級相關(guān)分析表明，Snail 蛋白在乳腺癌組織中表達的陽性率與有無腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)（r =0.600、P = 0.000，表 4）。

3 討論

乳腺癌惡性腫瘤細胞 EMT 在腫瘤細胞對原發(fā)部位的浸潤及遠處轉(zhuǎn)移過程中具有重要作用。EMT 過程中一個重要的分子事件就是鈣黏蛋白表達的異常，其中上皮標記物 E-cadherin 蛋白和間質(zhì)標記物 Vimentin 蛋白即為腫瘤轉(zhuǎn)移過程中最具代表性的兩種類型鈣黏蛋白[6-8]。本實驗研究結(jié)果顯示，在正常乳腺組織、乳腺癌癌旁組織和乳腺癌組織中 E-cadherin 蛋白的表達逐漸減少（100%、75%、56.7%），3 種組織間 E-cadherin 蛋白的表達差異具有統(tǒng)計學意義（P ＜ 0.05）。而 E-cadherin 蛋白在表達減少的同時，其在乳腺癌細胞內(nèi)的表達部位也隨之發(fā)生了相應(yīng)改變，表現(xiàn)為主要定位表達于細胞質(zhì)，而細胞膜則不明顯，這可能是因為此時E-cadherin 蛋白雖在細胞內(nèi)仍可合成表達，但卻不能良好的表達于細胞膜，導致其無法發(fā)揮應(yīng)有的黏附作用，使細胞間黏附力下降，提示在正常乳腺組織向癌組織的轉(zhuǎn)變發(fā)展過程中，細胞間黏附性的逐漸下降可明顯增加腫瘤細胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力。

有研究表明，間質(zhì)標記物 Vimentin 蛋白表達的增加和腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移特性具有普遍聯(lián)系[9]。而本研究結(jié)果顯示，隨著正常乳腺組織、乳腺癌癌旁組織至乳腺癌組織的轉(zhuǎn)變發(fā)展，Vimentin 蛋白的表達亦逐漸增強（0、40%、63.3%），3 種組織間Vimentin 蛋白表達的差異具有顯著統(tǒng)計學意義（P= 0.000），驗證了 Vimentin 蛋白表達的增加與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。同時 E-cadherin 和Vimentin 蛋白表達強度的相關(guān)性分析結(jié)果還表明，在乳腺正常組織的癌變過程中，E-cadherin 蛋白表達逐漸減少，而 Vimentin 蛋白表達則逐漸增加，兩者表達呈明顯負相關(guān)（P ＜ 0.05），更進一步證實了乳腺癌生長過程中存在上皮向間質(zhì)轉(zhuǎn)化的現(xiàn)象。因此，檢測 EMT 過程中兩種重要蛋白 E-cadherin和Vimentin 在乳腺癌組織中的表達及變化情況，可有助于了解乳腺癌組織中 EMT 的發(fā)生及進展，進而判斷惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展能力。

Snail 蛋白是一類鋅指轉(zhuǎn)錄因子，近來因發(fā)現(xiàn)其高表達與許多腫瘤發(fā)生發(fā)展的 EMT 過程有關(guān)而備受關(guān)注，認為 Snail 蛋白是EMT 過程中的關(guān)鍵調(diào)控因子[10-11]。本研究對乳腺癌組織中 Snail 蛋白的表達情況進行檢測后發(fā)現(xiàn)，在正常乳腺組織、乳腺癌癌旁組織和乳腺癌組織中 Snail 蛋白表達逐漸增強（0、30%、53.3%，P ＜ 0.05），表明Snail蛋白表達的增加與乳腺組織的癌變明顯相關(guān)。在此基礎(chǔ)上，對 Snail 與 E-cadherin、Vimentin 蛋白表達強度的相關(guān)性研究結(jié)果還表明，Snail 蛋白表達增加的同時還呈現(xiàn) Vimentin 蛋白表達逐漸上調(diào)而E-cadherin 蛋白表達逐漸減少的趨勢，這提示 Snail蛋白可能通過參與調(diào)控細胞標記物 E-cadherin、Vimentin 蛋白的表達而觸發(fā) EMT，使腫瘤細胞失去黏附能力，原發(fā)灶腫瘤細胞脫落分離，向局部浸潤，并進一步向淋巴結(jié)或遠處轉(zhuǎn)移，從而在乳腺癌的發(fā)展、侵襲和遠處轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用。2005 年，Moody 等[12]在乳腺浸潤性導管癌中發(fā)現(xiàn)了 Snail 蛋白的表達，進而提出 Snail 蛋白的表達與乳腺癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移和復發(fā)存在相關(guān)性。而本實驗在 Snail 蛋白表達與乳腺癌腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的相關(guān)性分析中也發(fā)現(xiàn)，32 例（32/60，53.3%）Snail 表達陽性的乳腺癌組織標本中，Snail蛋白的表達與乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移具有明顯相關(guān)性：Snail 陽性表達患者腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率較高（87.5%，28/32），而 Snail 表達陰性者僅有 8 例伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（28.6%，8/28），其差異具有統(tǒng)計學意義（P ＜ 0.05），與 Moody 等研究結(jié)果相一致，證實了 Snail 蛋白可明顯促進乳腺癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。綜上可以推測在 EMT 過程中，Snail 蛋白不僅是可調(diào)控乳腺癌發(fā)生發(fā)展和浸潤過程的一個樞紐，而且其對乳腺癌的遠處轉(zhuǎn)移也具有重要的推動作用。

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