結(jié)核分枝桿菌低劑量感染小鼠模型的建立與分析

林樹柱 董娜 向志光 徐艷峰 占玲俊 馬春梅 秦川

目前越來越多的研究表明，BCG作為臨床應(yīng)用的結(jié)核病疫苗，僅對幼兒嚴(yán)重的結(jié)核病有預(yù)防作用，但是對成年人結(jié)核病，尤其Mtb潛伏感染與再發(fā)，沒有效果［1－2］。據(jù)估計(jì)全世界有大約1/3的人口潛伏感染Mtb，這使得潛伏感染致結(jié)核病的再發(fā)成為一個(gè)嚴(yán)重的問題，潛伏感染結(jié)核病再發(fā)后，容易出現(xiàn)肺部空洞病變，是結(jié)核病傳播的重要傳染源［2］。但是，目前對于Mtb潛伏感染及再發(fā)結(jié)核病的機(jī)制尚缺乏足夠的了解，尚無有效的預(yù)防結(jié)核病再發(fā)的方法。因此，研究潛伏感染狀態(tài)下細(xì)菌的特征與機(jī)體的免疫反應(yīng)，了解細(xì)菌與機(jī)體的相互作用，開發(fā)有效的針對Mtb潛伏感染與結(jié)核病再發(fā)的疫苗和藥物是當(dāng)務(wù)之急。動(dòng)物模型是進(jìn)行致病機(jī)理研究和開發(fā)疫苗、藥物不可缺少的工具，而目前Mtb潛伏感染的動(dòng)物模型普遍存在經(jīng)藥物治療、或雖未經(jīng)藥物治療但組織荷菌量較高的問題，因此潛伏感染的動(dòng)物模型需進(jìn)一步研究。本研究采用100菌落形成單位（CFU）的 Mtb，通過尾靜脈注射的方式感染C57BL/6J型小鼠，制備了低劑量Mtb感染的小鼠模型，并對該模型的荷菌量、組織病理及部分免疫變化進(jìn)行了分析。以期對Mtb慢性持續(xù)感染或潛伏感染的研究提供有用的工具。

材料和方法

1.實(shí)驗(yàn)用菌株：小鼠感染用菌株為Mtb標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv（CMCC93009），由中國藥品生物制品檢驗(yàn)檢定所提供。實(shí)驗(yàn)用菌株的制備參照參考文獻(xiàn)［3］。菌株經(jīng)小鼠體內(nèi)2次增毒，置于Lowenstein－Jensen固體斜面培養(yǎng)基（美國BD公司）培養(yǎng)，收獲斜面培養(yǎng)3周的Mtb，在7H9液體培養(yǎng)基中研磨，經(jīng)5μm無菌濾器（Millipore公司）過濾，制成單細(xì)胞菌懸液，分裝、凍存于－80℃冰箱備用。單細(xì)胞懸液10倍系列稀釋，接種于Lowenstein－Jensen固體斜面培養(yǎng)基斜面，培養(yǎng)3周后計(jì)數(shù)，制備的單細(xì)胞懸液菌濃度為1.5×106CFU/ml。

2.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：實(shí)驗(yàn)中使用的小鼠為6～8周齡的雌性C57BL/6J小鼠，體質(zhì)量17～19 g，SPF（specific pathogen free）級，購自北京華阜康生物科技股份有限公司，合格證編號(hào)SCXK（京）2009－0004。小鼠的飼養(yǎng)與實(shí)驗(yàn)在中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所動(dòng)物生物安全3級實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)前1周，小鼠進(jìn)入動(dòng)物生物安全3級實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)環(huán)境。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的使用得到了中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用和管理委員會(huì)的批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號(hào)MC－09－2003）。

3.動(dòng)物的感染：Mtb單細(xì)胞懸液，用生理鹽水稀釋至400 CFU/ml。通過尾靜脈注射的方法感染小鼠，感染劑量為100 CFU/只小鼠，共感染小鼠40只。在感染后24周內(nèi)未出現(xiàn)結(jié)核病臨床癥狀，毛色、活動(dòng)度、飲食均正常，實(shí)驗(yàn)期間沒有小鼠死亡，按計(jì)劃分別在感染后1、3、5、8、12、16、20、24周取肺、脾、肝組織，進(jìn)行組織荷菌量、病理及細(xì)胞因子分析，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)取5只小鼠。

4.組織荷菌量分析：無菌操作所取左側(cè)整葉肺組織和1/2脾組織，先后經(jīng)生理鹽水、4%硫酸和生理鹽水漂洗，加1 ml生理鹽水用玻璃勻漿器研磨，組織懸液經(jīng)生理鹽水按照1∶10進(jìn)行梯度稀釋，取原倍、10－1、10－2、10－34個(gè)稀釋度的組織勻漿稀釋液100μl接種于Lowenstein－Jensen固體斜面培養(yǎng)基斜面，每個(gè)稀釋度平行接種3支斜面，37℃培養(yǎng)3周后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。取每個(gè)斜面上的菌落數(shù)在5～50 CFU范圍內(nèi)的稀釋度進(jìn)行組織荷菌量計(jì)算。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的5只小鼠用于荷菌量統(tǒng)計(jì)的稀釋度相同。荷菌量結(jié)果利用Excel軟件進(jìn)行分析。

5.病理分析：剩余的脾、肺及肝臟組織置4%中性甲醛固定液中固定7 d，脾臟組織按長軸橫切面進(jìn)行修塊，肺組織沿肺門方向修塊。石蠟包埋，切片厚度為4μm，之后進(jìn)行常規(guī)HE染色。由有經(jīng)驗(yàn)的病理專家統(tǒng)一按照每個(gè)切面的病灶類型、病灶大小和數(shù)量進(jìn)行病理學(xué)分析和評價(jià)。

6.IFN－γ檢測：小鼠摘眼球取血，靜置后離心得血清，－80℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｓ肊LISA方法分析小鼠感染后血清中IFN－γ的變化情況，ELISA試劑盒購自美國eBioscience公司，敏感度為15 pg/ml，操作按試劑盒說明書進(jìn)行。

結(jié) 果

1.肺、脾組織荷菌量分析：按實(shí)驗(yàn)計(jì)劃分別在感染后的不同時(shí)間點(diǎn)檢測小鼠的組織荷菌量。肺組織勻漿在感染后3周開始有個(gè)別小鼠可以檢測到極少量的Mtb，整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中小鼠肺組織荷菌量持續(xù)處于較低的狀態(tài)，荷菌量在0～103CFU之間，個(gè)體差異較大。因肺組織荷菌量在小鼠個(gè)體間差異較大，不適合進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，具體肺組織荷菌量結(jié)果未給出。

脾組織荷菌量結(jié)果如圖1所示，小鼠感染1周脾臟可以檢測到極少量的Mtb，脾臟組織的荷菌量為（2.13±0.75）lg CFU，此后結(jié)核分枝桿菌在小鼠體內(nèi)復(fù)制，荷菌量上升，在感染后3周小鼠脾臟荷菌量達(dá)到（4.97±0.19）lg CFU。在小鼠感染后5周脾臟荷菌量自然下降至（3.64±0.22）lg CFU，之后在較長一段時(shí)間脾臟荷菌量保持在一個(gè)較低的水平，感染后8周達(dá)到最低的（2.75±0.23）lg CFU，至感染后20周，荷菌量又明顯上升，達(dá)到（4.49±0.47）lg CFU，之后荷菌量持續(xù)緩慢上升。

圖1 小鼠感染H37Rv后脾臟荷菌量的動(dòng)態(tài)變化

圖2 小鼠感染后肺、脾、肝組織的病理變化

2.病理分析：小鼠感染后1周，肝細(xì)胞點(diǎn)灶狀壞死伴小灶性炎細(xì)胞浸潤；3周肝臟出現(xiàn)散在的小肉芽腫，脾臟出現(xiàn)肉芽腫，個(gè)別肺組織內(nèi)血管周圍少量炎細(xì)胞浸潤；5周肝、脾肉芽腫大小與數(shù)量進(jìn)一步擴(kuò)大，肺組織內(nèi)血管周圍炎細(xì)胞浸潤，偶見肉芽腫；8周病理改變減輕，肝、脾有少數(shù)肉芽腫，肺組織內(nèi)血管周圍少量炎細(xì)胞浸潤，恢復(fù)到與3周病理改變相似的程度；12周比8周略有減輕，肝、脾仍有少量肉芽腫；16周病變稍有加重，肝細(xì)胞點(diǎn)灶狀壞死伴小灶性炎細(xì)胞浸潤，肝、脾、肺均可見少數(shù)小肉芽腫；20周肝組織內(nèi)有少數(shù)小肉芽腫，脾組織肉芽腫，肺組織內(nèi)血管周圍炎細(xì)胞浸潤、少數(shù)肉芽腫；之后肝、脾、肺組織病變進(jìn)一步加重，肉芽腫大小與數(shù)量逐步增加，至24周病變程度與感染后5周近似。部分病理圖片如圖2所示。

3.IFN－γ檢測結(jié)果：結(jié)果如圖3所示，血清中IFN－γ的濃度在小鼠感染后3周出現(xiàn)升高，在感染后5周達(dá)到最高水平，此后血清中IFN－γ的濃度下降，至20周又開始上升。

討 論

圖3 小鼠感染后血清IFN－γ的含量動(dòng)態(tài)變化

Mtb感染小鼠模型是結(jié)核病研究中最常用的動(dòng)物模型之一。和人類一樣，小鼠能對Mtb感染產(chǎn)生強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)，而且小鼠相關(guān)的免疫試劑非常齊全，有大量的免疫指標(biāo)可以測定，所以人類對Mtb感染免疫的研究結(jié)果大多數(shù)都是利用小鼠模型得到的。小鼠結(jié)核模型易復(fù)制，感染實(shí)驗(yàn)室條件易控制，作為新藥評價(jià)模型也是非常經(jīng)濟(jì)有效的［1，4－5］。Mtb感染小鼠模型以模擬急性感染較多，對潛伏感染最著名的是Cornell模型［6］，但是此模型中，小鼠感染后經(jīng)過了抗結(jié)核藥物治療，與人類的自然潛伏感染存在較大的差異。本研究建立了一種Mtb低劑量感染小鼠的模型，該模型未經(jīng)過藥物治療的過程，在較長的時(shí)間內(nèi)維持了一個(gè)較低的荷菌水平，并且病理改變也有所減輕，在一定程度上可以模擬人類Mtb的慢性持續(xù)感染或潛伏感染的形態(tài)和過程。

本研究所選用的小鼠品系C57BL/6J對低劑量Mtb感染具有抗性［7］，尾靜脈注射的感染方式雖然不如氣溶膠感染的方式更能模擬人的自然感染，但是其比氣溶膠感染更容易在感染后將組織荷菌量控制在一個(gè)較低的水平［2，8］。感染用菌為 Mtb標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv，感染菌量為100 CFU/只小鼠。感染后1周小鼠脾臟均有Mtb檢出，而且小鼠感染后1～3周脾臟荷菌量升高了2.85 lg CFU，這些結(jié)果說明對小鼠的感染是成功的，并且感染所用菌株毒力可靠［9］。小鼠脾臟在感染后最初的3周內(nèi)，組織荷菌量迅速上升至（4.97±0.19）lg CFU，之后在未經(jīng)治療的條件下，脾組織荷菌量被機(jī)體自然控制，在感染后5周下降至（3.64±0.22）lg CFU，到感染后8周時(shí)更是下降到（2.75±0.23）lg CFU，比3周時(shí)下降了2.22 lg CFU。同時(shí)小鼠的病理變化也在感染5周之后自然減輕。推測小鼠脾臟荷菌量的顯著降低和病理變化的減輕，是由于小鼠對Mtb的獲得性免疫在感染后2周啟動(dòng)［10］，至感染3周后已經(jīng)全面建立，機(jī)體的免疫反應(yīng)起到了清除Mtb感染的作用，血清IFN－γ水平的變化也佐證了這一點(diǎn)。

之前已有文獻(xiàn)報(bào)道，小鼠感染后隨著獲得性免疫的建立，組織荷菌量也會(huì)達(dá)到一個(gè)穩(wěn)定的水平，不再升高，說明免疫反應(yīng)可抑制 Mtb的增殖。Phys等［2］的報(bào)道中之所以荷菌量下降得較少，推測可能是由于感染Mtb菌量比較高的原因。Radaeva等［11］用低劑量的 Mtb感染 （B6×I/St）F1小鼠，感染一段時(shí)間后，脾臟組織荷菌量也出現(xiàn)自然降低。經(jīng)尾靜脈感染的方式，小鼠肺組織Mtb出現(xiàn)得較晚［3］，在尚未達(dá)到較高的水平時(shí)，獲得性免疫已經(jīng)全面建立，并發(fā)揮作用，導(dǎo)致肺組織的荷菌量在感染后較長的一段時(shí)間內(nèi)都維持在一個(gè)很低的水平。與以往的報(bào)道相比，本研究建立的低劑量Mtb感染小鼠在未用藥物處理的情況下，通過機(jī)體自身的免疫反應(yīng)有效地控制了Mtb的感染，組織荷菌量明顯下降，病理損傷減輕，這為研究結(jié)核感染初期免疫反應(yīng)對Mtb的控制與清除提供了有效的工具。而且，感染小鼠組織的荷菌量比已有文獻(xiàn)報(bào)道的更低，并且在較長一段時(shí)間內(nèi)維持了體內(nèi)低帶菌的狀態(tài)，組織病變較輕，可用于Mtb慢性持續(xù)感染或潛伏感染的致病機(jī)理與免疫學(xué)研究，同時(shí)可為針對Mtb慢性持續(xù)感染或潛伏感染的藥物與疫苗的開發(fā)、評價(jià)提供有用的工具。

［1］Gupta UD，Katoch VM.Animal models of tuberculosis.Tuberculosis（Edinb），2005，85（5/6）：277－293.

［2］Phyu S，Mustafa T，Hofstad T，et al.A mouse model for latent tuberculosis.Scand J Infect Dis，1998，30（1）：59－68.

［3］向志光，林樹柱，董娜，等.結(jié)核分枝桿菌感染小鼠的脾臟和肺臟組織荷菌量與病理變化.中國比較醫(yī)學(xué)雜志，2011，21（8）：66－68.

［4］Apt A，Kramnik I.Man and mouse TB：contradictions and solutions.Tuberculosis（Edinb），2009，89（3）：195－198.

［5］袁偉，秦川.結(jié)核病動(dòng)物模型研究進(jìn)展.中國比較醫(yī)學(xué)雜志，2010，20（9）：55－59.

［6］黎友倫，王國治，羅永艾.結(jié)核分枝桿菌潛伏感染動(dòng)物模型及評價(jià).中華結(jié)核和呼吸雜志，2005，28（8）：552－554.

［7］Medina E，North RJ.Resistance ranking of some common inbred mouse strains to Mycobacterium tuberculosis and relationship to major histocompatibility complex haplotype and Nrampl genotype.Immunology，1998，93（2）：270－274.

［8］Kelly BP，F(xiàn)urney SK，Jessen MT，et al.Low－dose aerosol infection model for testing drugs for efficacy against Mycobacterium tuberculosis.Antimicrob Agents Chemother，1996，40（12）：2809－2812.

［9］Nuermberger E.Using animal models to develop new treatments for tuberculosis.Semin Respir Crit Care Med，2008，29（5）：542－551.

［10］Davis JM，Ramakrishnan L.The role of the granuloma in expansion and dissemination of early tuberculous infection.Cell，2009，136（1）：37－49.

［11］Radaeva TV，Nikonenko BV，Mischenko VV，et al.Direct comparison of low－dose and Cornell－like models of chronic and reactivation tuberculosis in genetically susceptible I/St and resistant B6 mice.Tuberculosis（Edinb），2005，85（1/2）：65－72.