探針熔解分析法快速檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌鏈霉素耐藥突變

陳春輝

(九江市第三人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，江西 九江 332000)

探針熔解分析法快速檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌鏈霉素耐藥突變

陳春輝

(九江市第三人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，江西 九江 332000)

目的對(duì)采用探針熔解分析法對(duì)結(jié)核分枝桿菌的鏈霉素耐藥突變情況進(jìn)行快速檢測(cè)的應(yīng)用價(jià)值進(jìn)行研究分析。方法抽取740株結(jié)核分枝桿菌的臨床分離菌株，采用探針熔解分析法，對(duì)鏈霉素耐藥突變情況進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果740株結(jié)核分枝桿菌中有86株發(fā)生突變，9份標(biāo)本中發(fā)現(xiàn)雜合信號(hào)，8份標(biāo)本中沒有任何信號(hào)。29份存在藥敏性的標(biāo)本的檢測(cè)結(jié)果均顯示為野生型，有耐藥性的13份標(biāo)本中僅有5份存在突變現(xiàn)象，另外的8份標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果顯示為野生型。結(jié)論采用探針熔解分析法對(duì)結(jié)核分枝桿菌的鏈霉素耐藥突變情況進(jìn)行快速檢測(cè)，其特異性非常明顯，且具有快速、準(zhǔn)確的特點(diǎn)。

探針熔解分析法；結(jié)核分枝桿菌；鏈霉素；耐藥突變

為了對(duì)采用探針熔解分析法對(duì)結(jié)核分枝桿菌的鏈霉素耐藥突變情況進(jìn)行快速檢測(cè)的應(yīng)用價(jià)值進(jìn)行研究分析，使臨床對(duì)對(duì)結(jié)核分枝桿菌的鏈霉素耐藥突變情況有更加全面的了解，為臨床提供對(duì)對(duì)結(jié)核分枝桿菌的鏈霉素耐藥突變情況進(jìn)行檢驗(yàn)的有效方法，使該項(xiàng)檢測(cè)方法在臨床上得到進(jìn)一步的普及和應(yīng)用，我們組織進(jìn)行了本次研究。在研究的整個(gè)過程中，我們抽取740株結(jié)核分枝桿菌的臨床分離菌株，采用探針熔解分析法，對(duì)鏈霉素耐藥突變情況進(jìn)行檢測(cè)。現(xiàn)將分析結(jié)果報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

抽取在2008年5月至2011年5月這三年時(shí)間內(nèi)收集的740株結(jié)核分枝桿菌的臨床分離菌株。野生型標(biāo)本選用H37Rv標(biāo)準(zhǔn)株，標(biāo)準(zhǔn)菌株盤采用特異性實(shí)驗(yàn)所用的包含37株非結(jié)核分枝桿菌的標(biāo)準(zhǔn)盤。

1.2 儀器

我院現(xiàn)有的普通PCR儀和實(shí)時(shí)PCR儀。

1.3 方法

采用試劑盒中所提供的提取液制備所需的PCR擴(kuò)增模板。具體的步驟包括以下幾點(diǎn):用接種環(huán)對(duì)固體培養(yǎng)基上的結(jié)核分枝桿菌進(jìn)行收集，使其懸于劑量為300μL提取液中。取1mL液體液體培養(yǎng)基上的結(jié)核分枝桿菌，在10000r/min的條件下進(jìn)行離心處理15min左右，將上清丟棄后在300μL的提取液中對(duì)細(xì)菌進(jìn)行重懸處理。采用封口膜進(jìn)行封口，99℃條件下加熱處理20min左右，然后在14000r/min條件下離心處理10min左右，將上清液移至1.5mL的離心管內(nèi)。即為PCR的擴(kuò)增模板，要采用紫外檢測(cè)方法對(duì)模板的濃度進(jìn)行定量，結(jié)核桿菌含量在103拷貝/μL以上。使用之前在-20攝氏度環(huán)境中保存[1]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

在本次研究過程中所得到的所有相關(guān)數(shù)據(jù)，均采用SPSS14.0統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)處理軟件進(jìn)行處理分析，P＜0.05時(shí)認(rèn)為有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié) 果

經(jīng)過仔細(xì)研究后我們發(fā)現(xiàn)，740株結(jié)核分枝桿菌中有86株發(fā)生突變，9份標(biāo)本中發(fā)現(xiàn)雜合信號(hào)，8份標(biāo)本中沒有任何信號(hào)。29份存在藥敏性的標(biāo)本的檢測(cè)結(jié)果均顯示為野生型，有耐藥性的13份標(biāo)本中僅有5份存在突變現(xiàn)象，另外的8份標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果顯示為野生型。

3 討 論

常規(guī)的一些抗結(jié)核類藥物是目前臨床對(duì)患有結(jié)核病的患者進(jìn)行化學(xué)藥物治療的一個(gè)基本方法，而對(duì)該類采用化學(xué)藥物進(jìn)行治療是對(duì)目前我們對(duì)結(jié)核病進(jìn)行有效控制的一種非常重要的手段。鏈霉素是在上個(gè)世紀(jì)的40年代被醫(yī)學(xué)界所發(fā)現(xiàn)的，是截止到目前為止，臨床上公認(rèn)的出現(xiàn)最早的對(duì)結(jié)核患者進(jìn)行治療的藥物，同時(shí)該藥物也是目前對(duì)患有結(jié)核病的患者進(jìn)行治療一種常規(guī)藥物。鏈霉素是一種比較常見的氨基環(huán)醇糖苷類抗生素藥物，該藥物在服用后主要會(huì)對(duì)結(jié)核分枝桿菌的核糖體產(chǎn)生作用，與核糖體上的30S亞單位發(fā)生特異性的結(jié)合反應(yīng)，誘導(dǎo)相關(guān)的遺傳密碼產(chǎn)生錯(cuò)配效應(yīng)，對(duì)mRNA翻譯整個(gè)進(jìn)行過程產(chǎn)生一定的抑制效果，對(duì)翻譯的校對(duì)過程也具有一定的干擾效果，從而對(duì)整個(gè)蛋白質(zhì)合成過程進(jìn)行有效抑制。鏈霉素在臨床對(duì)結(jié)核病患者進(jìn)行治療的過程中，通常采用單獨(dú)給藥方式，因此該藥物的耐藥性的發(fā)展速度非常快。

由于貧困、艾滋病、人口流動(dòng)過快和機(jī)體耐藥等因素的影響，目前全球范圍內(nèi)結(jié)核病的發(fā)病率和病死率正呈現(xiàn)出一種快速回升的發(fā)展態(tài)勢(shì)，已經(jīng)成為了臨床上與艾滋病對(duì)人類具有同等危害性的全球性的最危險(xiǎn)的一種傳染病。由于結(jié)核分枝桿菌的生長速度比較緩慢，經(jīng)增菌培養(yǎng)處理后再進(jìn)行藥物敏感性試驗(yàn)，通常情況下需要6周左右的時(shí)間，因此，對(duì)臨床上常見的一些自身具有非常強(qiáng)的耐藥結(jié)核病的患者進(jìn)行治療的過程中，無法提供一些更加及時(shí)的指導(dǎo)，使臨床實(shí)際治療過程中的需要很難得到充分的滿足，因此盡快找到一種對(duì)結(jié)核分枝桿菌的耐藥性進(jìn)行快速檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)方法是一個(gè)亟待解決的問題。近年來，通過不斷地研究已經(jīng)找到了一些能夠分子的水平對(duì)基因突變的具體情況進(jìn)行準(zhǔn)確檢測(cè)的方法，例如單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析法（SSCP），限制性片段長度多態(tài)性分析法（RFLP），DNA測(cè)序法，線性探針雜交法等，這些方法與前面所說的培養(yǎng)方法相比較，這些方法的檢測(cè)速度更快，能夠一定程度上使檢出率和通量得到提高，但是均需要進(jìn)行PCR后處理， 這不僅會(huì)對(duì)檢測(cè)的效率造成一定的影響，更容易將已經(jīng)擴(kuò)增的產(chǎn)物污染，而且在操作過程中的難度也會(huì)隨之加大，對(duì)實(shí)驗(yàn)室的儀器設(shè)備的實(shí)際要求會(huì)非常高。從這一點(diǎn)來講，實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)所具有的優(yōu)勢(shì)就非常明顯。首先，進(jìn)行實(shí)時(shí)擴(kuò)增處理時(shí)的檢測(cè)優(yōu)勢(shì)會(huì)相對(duì)更大一些，可以從根本上進(jìn)一步縮短檢測(cè)所需要的時(shí)間。在本次實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)行的整個(gè)過程中，對(duì)單個(gè)的樣品進(jìn)行檢測(cè)所需的時(shí)間僅為2h左右;省去了PCR的后處理的相關(guān)步驟，進(jìn)而進(jìn)一步降低了樣品在檢測(cè)過程中被污染的機(jī)會(huì);同時(shí)還有PCR的高效、快捷、簡便、經(jīng)濟(jì)等一系列優(yōu)點(diǎn)，可以對(duì)結(jié)核分枝桿菌的鏈霉素耐藥的突變情況的多個(gè)相關(guān)基因進(jìn)行檢測(cè)，適用于臨床對(duì)大批量的菌株進(jìn)行篩查[2]。

總而言之，采用探針熔解分析法對(duì)結(jié)核分枝桿菌的鏈霉素耐藥突變情況進(jìn)行快速檢測(cè)，其特異性非常明顯，且具有快速、準(zhǔn)確的特點(diǎn)，可以將該項(xiàng)檢測(cè)技術(shù)直接應(yīng)用于臨床檢測(cè)過程中。

[1]王超,朱中元.抗結(jié)核病藥物的研究進(jìn)展[J].中國熱帶醫(yī)學(xué),2008,18(14):674-675.

[2]王甦民.應(yīng)重視結(jié)核病的實(shí)驗(yàn)診斷[J].中華醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)雜志,2005,28(18):769-770.

R378.91+1

B

1671-8194（2012）14-0088-02