RVO伴發新生血管性眼病的發病機制及治療進展

張 楠 吳 烈 桑子瑾

視網膜靜脈阻塞（retinal vein occlusion，RVO）是最常見的視網膜血管病，也是常見致盲眼病〔1〕。其預后差的主要原因是易出現視網膜新生血管（retinal neovascularization，RNV）及與其相關的黃斑囊樣水腫、玻璃體積血、牽拉性視網膜脫離和新生血管性青光眼。由于新生血管結構和功能的異常，其伴隨出現的出血、滲出、增生等一系列病變，導致眼正常結構的破壞，造成嚴重的視功能損害。目前，臨床上治療RVO尚無非常滿意的藥物，很多措施是試驗性治療，無特效療法，防治并發癥特別是新生血管性眼病成為治療的主要目的〔2〕。隨著分子生物學、基因學等相關技術水平的提高和藥理學研究的進展，從血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）途徑探索RVO新生血管發生的機制以及尋求通過阻斷VEGF途徑來抑制新生血管的有效藥物、療法是目前研究的熱點之一。本文就近幾年RVO的常見并發癥——新生血管性眼病的研究進展做簡要綜述。

1 新生血管發生的因素和主要機制

1.1 新生血管發生的主要因素

目前普遍認為新生血管的發生主要與缺血缺氧有關，代謝應激（酸中毒）、力學應激（增生的細胞產生的壓力）、免疫炎癥反應等也是新生血管產生的因素。而RVO后形成的RNV主要是視網膜組織對缺氧的一種代償性反應。視網膜靜脈發生阻塞后，早期視網膜血液回流發生障礙，管腔壓力增高，小血管及毛細血管破裂出血，隨后毛細血管閉塞形成無灌注區，使血-視網膜屏障遭到破壞。這是當前普遍認同的缺血缺氧學說。張惠蓉〔3〕認為無灌注區超過7個視盤面積、壓迫點處靜脈受壓程度、始終無側支循環建立等與新生血管的形成密切相關。

1.2 相關細胞因子的局部調控

新生血管的形成是個極其復雜的過程，主要步驟包括血管內皮細胞激活，血管基底膜和細胞外基質（extra cellular matrix，ECM）降解，血管內皮細胞穿過基底膜遷移至血管周圍基質，內皮細胞增殖、相互黏附并連接，內皮細胞和周細胞相互作用，管腔結構形成以及血管外膜形成等。該過程受多種因素影響，是多種因子相互作用和調控的結果〔4〕。正常情況下，新生血管的誘導和抑制處于平衡狀態，而各種原因導致血管生成因子的上調和血管抑制因子的下調可將此平衡打破，引發新生血管的生成。隨著分子生物學研究水平的不斷提高，人們發現并提純了越來越多的參與新生血管生長的細胞因子，以VEGF、堿性成纖維細胞生長因子（basic fibroblast growth factor，b-FGF）、血小板衍生生長因子（plateletderived growth factor，PDGF）等為主要代表的促血管生成因子和以內皮抑素（endostatin，ES）、血管抑素（angiostatin，AS）、色素上皮衍生因子（pigment epithelium-derived factor，PEDF）等為主要代表的抑制因子在RNV的形成中起主要作用。而在眾多的細胞因子中，VEGF是視網膜新生血管生成必不可少的誘導因子，其他因子的血管生成作用全部或部分通過增強VEGF的表達和促進其生成起作用〔5〕。

VEGF作為血管生成因子大家族的一員，是高度特異的內皮細胞有絲分裂原，與血管新生密切相關，亦稱血管通透因子或血管調理素。Ferara等〔6〕從牛腦垂體濾泡星狀細胞體外培養液中將其分離、提純，根據其具有促血管內皮細胞有絲分裂活性而命名。VEGF有兩個主要的受體，Flt-1（fms-like tyrosine kinase 1）和 KDR（kinase insert domain-containing receptor），屬酪氨酸蛋白激酶類，具有高親和力，主要位于血管內皮細胞上并被其大量表達。當VEGF與受體特異性結合后，可激活蛋白激酶的活性，誘導受體磷酸化，從而引起細胞內許多酶和其他反應，發揮其生物學作用。

正常眼視網膜色素上皮細胞、血管內皮細胞、周細胞等可產生較低水平的VEGF，基礎水平的VEGF起著維持原有血管密度及維持血管對運輸營養物質所必需的通透性的作用。在缺血缺氧性視網膜病變中，VEGF參與血-視網膜屏障的破壞，于疾病的早期出現，并持續存在于整個疾病過程中〔7〕：（1）血流量減少致使視網膜灌注不足，視網膜氧分壓降低，可激活缺氧誘導的轉錄因子，誘導VEGF的表達。缺氧誘導因子 1（hypoxia-inducible factor-1，HIF-1）是 1992 年 Semenza等首次在低氧的肝細胞癌細胞株的細胞核提取物中發現的一種能特異性結合于紅細胞生成素（erythropoietin，EPO）基因的低氧反應元件上的蛋白，是維持氧自穩平衡的核心調控因子，調控一系列缺氧相關基因的表達，也是血管生長信號途徑的關鍵上游轉錄因子。HIF-1主要由α和β兩個亞單位組成，β亞基在細胞內呈構成性表達，不受氧濃度的影響；α亞基在正常情況下經泛素蛋白酶途徑降解，在低氧的條件下降解無法完成而與β亞基結合成有活性的HIF-1。HIF-1被缺氧信號激活后，與VEGF 5’端增強子相互作用，增加視網膜色素上皮細胞、血管內皮細胞、周細胞等的VEGF表達，增高的VEGF以自分泌和旁分泌的方式特異性地作用于血管內皮細胞的VEGF受體（KDR），調控內皮細胞分化和血管生成，以增加供氧，維持細胞和機體氧自穩平衡。（2）內皮細胞激活后，血管擴張，尤其是微靜脈、小靜脈滲透性增加，血漿大分子外滲沉積在血管外的基質中，部分外滲的纖維蛋白原可形成纖維蛋白凝膠，支持內皮細胞生長，為新生毛細血管網的建立提供營養。其主要機制為VEGF受體發生磷酸化，繼而激活磷脂酰膽堿特異性磷脂酶C，后者水解磷脂酰肌醇二磷酸，產生二脂酰甘油和肌醇三磷酸，激活細胞質中的蛋白激酶C（protein kinase C，PKC），PKC的激活可導致血管基底膜和周細胞外基質的蛋白的溶解，微血管內皮細胞通過血管基底膜浸潤、遷移進入鄰近細胞外間質形成新生血管芽〔8〕。PKC的活性增高，可使視網膜內皮細胞VEGF基因啟動子與核轉錄因子 κB（nuclear transcription factor kappaB,NF-κB）的連接活性增加，促進VEGF表達；增高的VEGF又反向促使PKCα、PKCβⅡ膜轉位，從而加重血-視網膜屏障的破壞，使血管通透性增高〔9〕。（3）VEGF 可以上調細胞間黏附分子-1（intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1）的基因表達〔10〕，增加視網膜血管ICAM-1的轉錄，可能促成白細胞活化并聚集于受損部位的血管，在趨化劑的作用下，游出血管，積聚缺血部位，吞噬壞死組織碎片、致病原，釋放炎性介質、酶性顆粒等毒性物質，在發揮保護作用的同時也損傷了視網膜的正常細胞，引起一系列的炎癥反應，從而加重了視網膜缺血后的結構損傷和功能障礙。在培養基中加入VEGF可增加牛視網膜內皮細胞單核細胞黏附和ICAM-1表達，然而加入抗 VEGF抗體則可抵消此效應〔11〕。（4）VEGF還充作“旁分泌”介質，介導轉化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β），參與調控新生血管的形成。TGF-β屬一組調節細胞生長和分化的小分子蛋白，可促進基質蛋白的合成和分泌。近年來有報道〔12〕TGF-β的表達可增加視網膜色素上皮的通透性，降低纖維連接蛋白的水平，造成血視網膜屏障的破壞。

1.3 相關細胞因子的全身調控

在胚胎發育期和出生后血管重建期存在兩種血管形成方式。一種是血管發生，即通過血管內皮祖細胞（也稱成血管細胞）聚集、分化形成新生血管，多發于胚胎發育極早期；另一種是血管生成，即通過原有血管中細胞增生、移行形成新生血管網。雖然這兩種血管形成方式有本質的區別，但血管發生與血管生成均依賴于KDR激活，均在胚胎血管發育和出生后血管重構中發揮作用〔13〕。出生后，血管生成作為主要血管形成方式參與生理性血管重建和病理性新生血管形成。但是，近年來越來越多臨床與實驗室證據表明：雖然血管生成在病理性新生血管形成過程中起主要作用，但在新生血管區內還富集了來自體循環的骨髓來源細胞（bone marrow-derived cells，BMCs）。 這些 BMCs 包括內皮祖細胞（endothelial progenitor cells，EPCs）、造血干細胞（hematopoietic stem cells，HSCs）、間充質干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs），具有自我更新能力，至少能分化成一種成熟細胞〔14〕。

一系列研究發現骨髓中存在血管內皮祖細胞（EPCs），而且外周血來源于骨髓〔15〕，不少文獻己證實，骨髓中造血干細胞分化成EPCs，在VEGF或缺血、血管損傷等刺激下，可以動員并遷移至病變組織局部，增殖分化為成熟內皮細胞，它在體內具有明顯的內皮修復和促血管新生作用〔16〕。

骨髓間充質干細胞（bone marrow stroma cell，BMSC）幾乎可以分泌血管再生所需的各種細胞因子，其中，VEGF對血管形成的調控占主導地位。BMSCs分泌VEGF的主要影響因素為環境中氧氣濃度，缺氧可使局部組織中的BMSCs通過旁分泌途徑分泌VEGF至相關區域，參與視網膜血管內皮細胞增殖，促進新生血管的生成。Li等〔17〕在小鼠下肢缺血模型中移植給予預先24 h缺氧刺激的BMSCs，結果VEGF mRNA表達量較對照組高2.5～5倍，VEGF表達量也極大增加。而視網膜缺血缺氧時VEGF mRNA表達的變化，目前文獻中鮮有報道。

2 新生血管性并發癥的藥物治療進展

人們對RVO的認識己經經歷了100多年的發展，然而從分子水平對RVO病因和發病機制的闡述有待進一步明確，目前臨床上治療RVO尚無非常滿意的藥物，很多措施是試驗性治療，無單一特效方法，防治其并發癥特別是新生血管性眼病成為臨床治療的主要目的。近年來的研究主要從新生血管發生的機制入手，通過抑制VEGF的啟動、活化、效應等階段，多靶點、多途徑干預眼內新生血管生成，期盼早日找到安全、滿意的抑制和阻斷RNV產生的藥物。目前臨床已應用并引起廣泛關注的有VEGF阻斷或抑制藥物、中醫的辨證用藥以及基于藥理作用研究的中藥治療。

2.1 抗VEGF抗體

2.1.1 貝伐單抗（bevacizumab）：又稱 rhuMAb，商品名為Avastin，是重組人VEGF的單克隆抗體，分子量為149 kb，是首個于2004年2月通過美國食品與藥物管理局（Food and Drug Administration，FDA）認證并批準上市的VEGF抑制劑，批準用于轉移性結直腸癌的治療。它與VEGF有2個結合位點，能結合和阻斷所有VEGF的異構體，其抗新生血管的主要機制為阻斷VEGF與內皮細胞表面的VEGF受體結合，使內源化VEGF的生物活性失效，抑制內皮細胞有絲分裂，減少血管通透性，阻礙新生血管的形成。由于它具有阻斷VEGF誘發的內皮細胞信號傳導的作用，一些眼科專家開始嘗試將其用于治療眼部新生血管，并且短期內已顯示出較好的安全性和療效〔18-19〕。2005年7月，Rosenfeld PJ在美國視網膜專科年會上首先提出Avastin玻璃體腔內注射治療年齡相關性黃斑變性（age-related macular degeneration，AMD）繼發的 CNV和視網膜中央靜脈阻塞（central retinal vein occlusion，CRVO）有效，引起人們的廣泛關注。Avery等〔20〕給予79例AMD患者玻璃體腔內注射1.25 mg的bevacizumab，每個月給藥1次，15周后OCT顯示視網膜厚度變薄，多數患者CNV區熒光滲漏減少，未出現嚴重的眼部及全身副作用。Iturradle等〔21〕對15例CRVO患者行玻璃體腔內注射Avastin治療，每只眼的注射劑量均為1.25 mg，術后發現患眼視網膜新生血管消退、視網膜平均厚度降低，視力也顯著提高。

2.1.2 蘭尼單抗（ranibizumab）：又稱rhuFabV2，商品名為Lucentis，是第二代人源化的抗VEGF重組鼠單克隆抗體片斷，具有與貝伐單抗類似的結構和作用，能夠結合并抑制VEGF所有的活性異構體及其降解產物，可以完全滲透視網膜全層〔22〕。2006年6月獲美國FDA批準用于治療AMD的黃斑下新生血管，目前已在85個國家上市，用于治療濕性老年性黃斑病變。在美國，本品也已獲準用于治療RVO性黃斑水腫。該藥的不良事件少，主要是眼痛、飛蚊癥、眼內壓升高，嚴重的副作用與注射有關，包括眼內炎、視網膜脫離、視網膜撕裂和外傷性白內障、視網膜色素上皮層撕裂、動脈血栓〔23-24〕。

2.2 抗VEGF適體

適體是一種能與多種配體特異、高效結合的RNA或DNA片段，抗VEGF適體對人可溶性VEGF同分異構體VEGF 165有高度親和力，并可與其特異性結合。哌加他尼鈉（pegaptanib sodium），商品名Macugen，是Eyetech和輝瑞公司聯合生產的抗VEGF的核酸適體藥物，于2004年12月成為第一個獲得FDA批準的治療年齡相關性黃斑變性（AMD）新生血管的VEGF抑制劑〔25〕。適體無免疫原性，在體內不會引起免疫排斥反應，且易于改造修飾從而改善其在體內的穩定性和滯留時間，這些特點使其非常適合于作為一種治療藥物。哌加他尼鈉是一種化學合成的寡核苷酸序列，可特異性與VEGF165結合，抑制其生物活性，阻礙其與細胞受體結合，從而阻斷其促進內皮細胞增殖和增加血管通透性信號的傳出。研究證明哌加他尼鈉對CRVO、黃斑水腫、新生血管性青光眼等病的新生血管消退都有良好的效果〔26〕。

2.3 VEGF Trap-Eye

抗血管內皮生長因子充足蛋白VEGF Trap-Eye是Regeneron公司基于Trap技術平臺開發的一種強力VEGF阻斷劑，是將人flt-1的免疫球蛋白區結構域2和KDR的免疫球蛋白區結構域3融合到人IgG Fc片段的可溶性受體。VEGF Trap能高效地結合所有的VEGF異構體，減少VEGF所致的血-視網膜屏障的破壞。VEGF Trap與單克隆抗體相比，對VEGF有著更強的親和力，理論上在較低劑量時就能產生極大的藥效。給光感受細胞表達VEGF的轉基因小鼠皮下注射VEGF-TRAPR1R2也能顯著抑制視網膜下新生血管形成及血管滲漏?；谠趦身椃謩e名為VIEW 1和VIEW 2的Ⅲ期臨床研究中獲得的陽性結果，Regeneron制藥公司與其合作伙伴拜耳（Bayer）制藥公司于2011年7月在歐盟遞交了將抗VEGF重組蛋白VEGF Trap-Eye用于治療濕性AMD新生血管的上市申請。

2.4 抗VEGF受體

可溶性 Flt-1（soluble Flt-1，sFlt-1）由內皮細胞分泌，能與細胞膜表面受體Flt-1競爭結合VEGF，并且能與細胞膜表面受體Flt-1及KDR形成同源或異源二聚體，從而阻斷VEGF活性。張敏〔27〕等通過實驗構建了攜帶sFlt-1基因片段的重組慢病毒（lenti sFlt-1），將lenti sFlt-1注入小鼠玻璃體腔后，熒光素灌注視網膜鋪片結果顯示視網膜熒光素滲漏等異常的視網膜新生血管表現顯著減少，眼球連續切片蘇木精-伊紅染色亦發現突破視網膜內界膜的血管內皮細胞核數明顯減少。該研究表明慢病毒介導的sFl-t1基因片段的轉移能有效抑制小鼠視網膜新生血管的發生，初步肯定了sFlt-1在視網膜新生血管疾病方面的研究價值，為人視網膜新生血管疾病的防治提供了一個新的方向。

2.5 siRNA

RNA干擾（RNA interference,RNAi）是一種高度序列特異性的、保守的轉錄后基因沉默，是由小片段干擾性RNA（siRNA）誘導引起的同源性基因抑制。siRNA由21～23個核苷酸組成，作用靶點不同于前面介紹的藥物，它通過結合與其有互補序列的mRNA并使其降解，從而達到抑制靶基因表達的目的。選用針對VEGF的siRNA可以高效、特異性地促進VEGF mRNA降解，阻斷VEGF同源基因的表達，維持細胞內VEGF的長期低水平，而不是阻斷已表達的VEGF。研究證實，一些利用siRNA技術開發的藥物如Cand5和ALN-VEG01，在體內外的缺氧條件下均可以降低VEGF的表達〔28〕。另有研究表明，針對高氧誘導的小鼠視網膜新生血管病變模型，采用脂質體介導，玻璃體腔顯微注射VEGF165 siRNA表達質粒pSilencer2 1-U 6 hygro，可以有效抑制小鼠缺血性視網膜病變模型新生血管的形成〔29〕。

此外，尚有針對HIF-1α的siRNA，利用基因轉染體外培養人血管內皮細胞的研究證實HIF-1α siRNA能有效抑制HIF-1α的表達，而且HIF-1α siRNA在缺氧環境中亦能發揮RNA干擾效應。研究者推測，HIF-1α siRNA同樣能在視網膜新生血管活體實驗中抑制HIF-1α的表達，達到抑制新生血管形成的目的〔30〕。

2.6 酶抑制劑

酪氨酸激酶抑制劑通過結合胞內VEGF受體的酶活性結構域，阻止受體磷酸化抑制酪氨酸激酶活性，從而有效的抑制VEGF介導的血管生成作用。VEGF受體酪氨酸激酶抑制劑可能比以VEGF作為靶點的藥物更為有效。在缺氧誘導的鼠RNV模型中，每日玻璃體內注射PTK787可以減少增殖性視網膜病變〔31〕。

絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）抑制劑阻斷VEGF通過級聯信號將胞外刺激傳遞至細胞核，干擾磷酸化轉錄因子調節細胞功能所致的細胞形態學變化，從而調節內皮細胞的遷移、增殖、分化和存活。Bullard LE等〔32〕證實，兩種絲裂原活化蛋白激酶細胞外信號反應性激酶 1（extracellular signal responsive kinases，ERK1）和ERK2的抑制劑AG126及ERK激酶的抑制劑PD98059，呈現劑量相關性抑制ERK的磷酸化和內皮細胞的增殖。在大鼠ROP模型中，玻璃體腔注射一定量的AG126及PD98059,對新生血管的抑制率分別達71%和48%。

基質金屬蛋白酶組織抑制劑（tissue inhibitor of metalloproteinase，TIMP）與基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）以一種復雜的方式調控視網膜新生血管的形成，而不僅僅是簡單地改變蛋白水解酶的活性而引起內皮細胞侵襲，它們之間平衡的破壞是新生血管產生的重要原因。新生血管形成中，降解ECM組件打開內皮細胞移行的途徑必需有MMP，VEGF可以上調MMP的表達。MMP-2的C末端水解片段、血紅素結合蛋白片段及MMP的廣譜抑制劑Batimastat對視網膜新生血管可望有良好的抑制作用〔33〕。

NAD（P）H氧化酶抑制劑——apo-cynin是一種特異性的酶抑制劑，Mohamed等人研究發現病理性的血管生長和中心視網膜的血管重建都能被apo-cynin阻止，這說明NAD（P）H氧化酶的活性對于生理和病理性的血管生成都是必需的。他們所做的體內和體外研究表明這其中的部分原因可能與VEGF的表達被抑制有關。因此，在氧化應激期間將NAD（P）H氧化酶抑制劑用于緊急治療可能是阻止新生血管形成的有效措施，特異性的NAD（P）H氧化酶抑制劑可能會為治療缺血性視網膜新生血管發生提供一種新的方案〔34〕。

2.7 中醫藥治療

國內眼科工作者對中醫藥治療RVO伴發新生血管性眼病進行了有益的探索，基于中醫理論的辨證施治和基于藥理作用研究的中藥治療，為多靶點、多途徑干預眼內血管新生提供了可靠的依據。如李晟〔35〕等認為本病當屬本虛標實，瘀血阻絡為其基礎，久瘀傷及陰血，陰血不足則虛熱內生，虛熱傷津則血液黏滯，阻塞脈道；另外虛熱迫血妄行，則使血液運行失其常道，故產生RNV，治療多采用辨病和辨證相結合治療。龐朝善〔36〕等強調對于RNV不可濫用活血化瘀藥，并慎用破血之品，多采用補腎健脾、理血通絡之法治療新生血管。王明芳認為，新生血管病在孫絡，多屬久病入絡所致，且久病傷及肝腎，故治療藥絡虛通補，補益肝腎，加之新生血管易滲漏出血的特點，治療時應先予涼血活血藥物治標，避免采用活血化瘀藥物，后期予滋養肝腎為法，加用軟堅散結藥促使新生血管萎縮，以治其本，方用四君子湯或參苓白術散合生蒲黃湯加減，或加用云南白藥膠囊〔37〕。 田或〔38〕等實驗研究認為大劑量燈盞細辛能促進視網膜新生血管部分萎縮。另有研究表明，補氣活血中藥（血栓通、黃芪）的干預可抑制VEGF的表達，達到減少和延緩視網膜新生血管的形成和發展〔39〕。李景恒等〔40〕認為活血化瘀藥物三七和丹參能減少血管增生性視網膜病變小鼠的VEGF含量，可通過改善局部缺氧環境或影響各種新生血管生長因子而阻止視網膜新生血管形成。彭清華根據津血同源的的理論強調治療上應水血同治，以視網膜切片免疫組織化學染色法觀察并證實了活血利水之散血明目片可抑制VEGF的表達，從而抑制缺氧誘導的視網膜新生血管的形成〔41〕。

3 總結

RVO伴發新生血管性眼病是眼科常見的致盲原因，如何有效抑制和控制新生血管的產生和生長，防治與其相關的黃斑囊樣水腫、玻璃體積血、牽拉性視網膜脫離和新生血管性青光眼，一直是困擾眼科學界的一個棘手問題。隨著分子生物學、基因學等相關技術水平和藥理學研究水平的不斷提高，人們正試圖從VEGF途徑逐步揭示新生血管的形成及其調控機制，這將為臨床提供更多依據來研究和治療新生血管性眼病。以上諸多的藥物為防治新生血管性眼病展示了美好前景，然而新生血管的發生機制較為復雜，藥物治療的研究重點應該放在藥物作用的靶點、途徑、特異性以及藥物在體內的藥代動力學等方面，從而找到最為安全有效的抑制新生血管的藥物。VEGF阻斷或抑制藥物的臨床試驗取得了令人驚喜的結果，但這些試驗研究觀察時間尚短，尚不能反映玻璃體腔注射VEGF阻斷和抑制藥物的長期有效性和安全性，而且在治療過程中，隨著注射次數的增加，感染和并發癥的風險會隨之升高，患者的經濟負擔也隨之加重。因此，今后還需對這些藥物進行長期的、大樣本的、多中心的隨機臨床對照試驗，觀察其療效和安全性，進一步確定其有效劑量、安全劑量、注藥次數以及注藥時間間隔等。中醫藥通過抑制組織中VEGF表達和改善組織微環境，在減輕視網膜激光光凝副作用以及保存RVO患者有效視力方面具有一定效果，為中西醫結合治療視網膜靜脈阻塞伴發的新生血管性眼病提供了一條切實、可行的途徑，但其改善組織缺氧的機理尚未十分明確，對VEGF的調控機制還需更為深入的研究和探索。

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