核糖核苷酸還原酶和非小細胞肺癌

許南榮 李輝 鄭雅文 閻云

肺癌在全世界是癌癥相關造成死亡的最常見原因，全球每年死于肺癌人數占所有死亡人數的3.1%，占所有癌癥死亡人數的17.6%，排第一位[1]。在臺灣，惡性腫瘤自1982年迄今，一直居十大死亡之首位。而其中15%-20%是因肺癌而死亡，據統計2010年死于肺癌的人數占所有癌癥死亡人數的20.0%（8,209/41,046），位居十大癌癥死亡原因第一位，且有逐年增加的趨勢[2]。癌癥發生的原因非常復雜，與先天遺傳、生活飲食習慣、居住環境、職業等內外因素有關，流行病學調查顯示肺癌的發生和吸煙（包括二手煙）、空氣污染、職業因素（如石棉）、放射線物質（如氡氣）、遺傳因素、慢性疾病、性別因素、病毒感染（如人乳頭狀病毒）或其它危險因素有關。

和其它許多癌癥類似，肺癌的發生源于癌基因的激活，或抑癌基因的失活[3]。癌基因指的是那些使人容易得癌癥的基因。通常認為原癌基因在遇到致癌物以后會變成癌基因[4]。大鼠肉瘤蛋白（ratsarcoma, RAS）原癌基因的突變大約造成10%-30%的肺腺癌[5,6]。表皮生長因子受體（epithelial growth factor receptor, EGFR）控制著細胞的分裂、凋零，抑制血管生成和腫瘤侵蝕[5]。EGFR基因突變和擴增在非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）中很常見，因此才有采用EGFR抑制劑的治療基礎。染色體損傷會導致基因雜合缺失，這可造成抑癌基因失活。多種基因多態性和肺癌有關，包括白細胞介素-1[7]、細胞色素P450[8]、細胞凋亡的促進因子（比如caspase-8）[9]和DNA修復分子（比如XRCC1）[10]。攜帶這些基因多態性的人在接觸致癌物質后更容易罹患肺癌。最近的研究[11]發現對位基因MDM2 309G也是亞洲人得肺癌的一個風險因素。

核糖核苷酸還原酶（ribonucleotide reductase, RR）在將核苷酸雙磷酸轉化為2'-脫氧核苷酸雙磷酸中扮演一必要的角色，接著形成脫氧核苷酸三磷酸，用來提供DNA合成和修復過程必需的RR。因此RR的表達在細胞內定位和功能中都受到高度調節[12]。因為RR在DNA合成中扮演如此關鍵的角色，所以它也是癌癥治療重要的標靶[13]。有關RR和肺癌的相關問題，本文綜述如下。

1 RR的分子結構與相關研究

在RR全酶的分子中，包括一個α大次級單位和一個β小次級單位組合成一個α2β2異四分子，RR的活性需要這樣的分子組成[12]。在人類，RR已被確認具有一個大次級單位（M1）和兩個小次級單位（hRRM2和p53R2）[14]。大次級單位（hRRM1）包括基質和異位作用位置，可以控制RR全酶活性和基質特異性[15,16]，RR次小分子形成兩個對等中心含鐵雙核，這使得酪氨酸自由基穩定，可在催化時啟動電子傳遞[15,17]。RR兩個小次級單位（hRRM2和p53R2）的蛋白質序列有80%的相似度[14]。試管測定發現組合成p53R2的蛋白質和hRRM2都會和hRRM1作用而形成一全酶，使得胞嘧啶核苷酸雙磷酸（CDP）轉化成脫氧胞嘧啶核苷酸雙磷酸（dCDP）[18,19]。雙鐵雙酪氨酸關鍵中心被認定是RR活性中心，位于p53R2和hRRM2共同凹袋結構結合位置[20]，使用一合成八勝肽分子抑制RR活性，發現p53R2會經由與hRRM2一樣的主控結合位置和hRRM1結合[20]。

p53R2和hRRM2是RR兩個小次級單位，兩者有一些不一樣的特征，p53R2一直被認為是p53核蛋白的轉錄標靶[14,21,22]。而在轉錄時hRRM2是被細胞周期有關因子如NF-Y[23,24]和E2F[25,26]所調控。在正常生理情況下，hRRM1和p53R2可以在G1-G0時被探測出來；但是在不分裂的休息細胞中hRRM1似乎不會去結合p53R2或涉入脫氧核糖核苷酸三磷酸（dNTPs）的合成[21,26]。研究[27]發現不增殖細胞并不具有RR活性，造成細胞中脫氧核糖核苷酸三磷酸（dNTPs）濃度較低；而在增殖細胞中，hRRM2在細胞位置和表達則與S期有關[27,28]。

在野生型p53細胞中，面對DNA受損的反應，p53R2（而不是hRRM2）會參于 DNA修復。然而，當p53沒有功能，在面對UV照射時， hRRM2能夠補充p53R2功能[29]。由于p53R2和hRRM2在結構和功能上的不同，激起許多學者對RR兩個小次級單位更進一步的研究。

2 RR和癌化研究

研究[30]發現癌細胞成長、侵犯和進一步轉移可能涉及成長因子Ras/Raf/mitogen被活化蛋白激酶的信號傳遞路徑，這需要一些相關基因被活化。合成的小老鼠核糖核苷酸還原酶小次級單位R2（與人類的M2同質）過度表達時會造成膜相關Raf-1表達增加30%、MAPK-2活性增加70%以及Rac-1活性增加3倍，造成在BALB/c 3T3和 NIH 3T3細胞會有很明顯的轉移潛力增加[31]。這些發現顯示R2蛋白不僅是RR的一個速率限制因子，而且能夠和一些致癌基因包括v-fms、v-src、A-raf、v-fes、c-myc和ornithine decarboxylase合作，提升惡性轉型和癌化作用[32]。有趣的是，小老鼠和人類細胞株的基因轉殖實驗[20,33]都發現核糖核苷酸還原酶大分子M1（小老鼠是R1）具有抑制惡性潛力的作用。最近Rahman等[34]發現以小白鼠為實驗模型，將RRM2以RNA干擾（RNA interference, RNAi）剔除，會強烈抑制頭頸部鱗狀細胞癌細胞株和NSCLC細胞株的生長，并且將針對RR次級單位M2（RRM2）的短干擾RNA（short interfering RNA, siRNA）納米粒子由靜脈打入，會抑制腫瘤侵犯并抑制細胞的增生，進而造成細胞凋亡。有關p53R2分子作用機制，Zhang等[35]針對p53R2的受酶特征和抑制p53R2的試管研究發現，p53R2和hRRM2對hRRM1的結合力不同，hRRM2對hRRM1的結合力是p53R2對hRRM1的結合力的4.76倍，而RR抑制劑Triapine，則對p53R2和hRRM2的作用強度一樣。這些研究可以對癌癥治療有一新的指引方向[18]。Zhang等[35]發現p53R2抑制人類癌細胞增殖，是通過上調p21、下調cyclin D1，使細胞生長循環停止，因此，p53R2不僅在修補DNA受損，而且也在人類癌細胞增生中扮演關鍵角色[35]。Piao等[36]最近的研究發現MEK2可通過與p53R2作用， 調節RR活性，如減少MEK2的活性，使RR活性明顯減少，說明p53R2受到MEK2-dependent途徑的調解具有特異性。

3 RR在NSCLC患者的相關轉譯研究

3.1 RRM1、RRM2和p53R2表達在臨床研究中的意義Bepler等[37]探討RRM1和PTEN表達對NSCLC患者預后的臨床意義，發現RRM1的表達與PTEN表達和RRM2表達明顯相關，而RRM1和PTEN高表達患者存活較久且疾病復發較晚。多元變項分析發現RRM1高表達是預測長期生存的因素，與腫瘤分期、生活狀態和體重減輕無關。Zheng等[38]研究187例僅接受手術治療的NSCLC，發現RRM1高表達的病患（＞120個月）比RRM1低表達的病患（54.5個月）的存活率好，且具有統計學差異。由于RRM1一直被學者認為是細胞內化學藥劑吉西他濱的目標，RRM1在許多類型腫瘤病患中都被研究過，例如NSCLC、胰臟癌、乳腺癌、膽道癌。當這些病患使用吉西他濱治療時，RRM1 mRNA的表達和基因的變異都會與這些病患的臨床預后有關[39]。而Zhou等[40]報道使用hRRM2單克隆抗體進行免疫組織化學染色發現，在人類結腸癌、胃癌、肝癌、肺癌、胰臟癌和乳腺癌中hRRM2均有較強染色。研究結果建議可使用此抗hRRM2單克隆抗體做RR的研究和作為腫瘤癌化標記物。Simon等[41]最近的研究顯示，針對NSCLC末期病患，可根據ERCC1和RRM1表達高低調制不同的化療治劑，如RRM1表達低，則使用吉西他濱；RRM1表達高，則使用長春瑞濱或多西他賽；ERCC1表達高，則使用多西他賽；ERCC1表達低，則使用卡鉑。如此量身打造的化學治療會比一般常規使用化學治療得到明顯較長的存活率。至于p53R2表達在NSCLC中的臨床研究，文獻并不多見。Uramoto等[42]研究結果不支持p53R2表達在NSCLC中可以發揮重要的預后作用，p53R2介導的DNA修復途徑可能負責控制肺癌的增長。然而Hsu等[43]研究發現p53R2蛋白表達在早期NSCLC中與癌細胞分化有負向相關。p53R2陽性表達明顯有較好的存活率（P=0.022）。這點和Uramoto等[42]報道不同。因此，我們認為p53R2表達在晚期和早期NSCLC病患中可能扮演不同角色。有趣的是在食道癌中也有同樣的發現，學者報告在食道癌和口腔癌中p53R2表達與腫瘤侵犯性、淋巴腺轉移和腫瘤大小有關[44,45]，而p53R2在晚期食道癌比早期病患中表達較高[44]。Hsu等[46]為了探討p53R2和hRRM2在腫瘤進行的角色，以免疫組織化學在染色組織微列陣中，探討p53R2和hRRM2蛋白在NSCLC中的表達。對92例早期NSCLC病例進行研究，發現25例表達hRRM2，占27.2%；而42例表達p53R2，占45.6%。Kaplan-Meier分析顯示p53R2陰性表達病患比p53R2陽性表達病患的平均整體存活天數短（660 d vs 900 d, P=0.025）。另外發現hRRM2陽性表達病患比hRRM2陰性表達病患的平均整體存活天數短（660 d vs 960 d, P=0.044）。此外，p53R2+/hRRM2-或p53R2-/hRRM2-病患比p53R2-/hRRM2+或p53R2+/hRRM2+病患的存活率高（P=0.003）。研究[46]發現p53R2蛋白表達在早期NSCLC中是一個有利預后因素和預測復發生物因子，p53R2蛋白表達在早期肺癌似乎比hRRM2更重要。p53R2蛋白表達不僅可作為整體存活率的獨立生物因子，也可以當作腫瘤復發的指示劑。

3.2 有關RR抑制劑的研究 Tu等[47]1999年開始使用小白鼠做研究，以RRM1反義：GTI-2501，作為RRM1抑制劑，針對各種不同人類腫瘤細胞株進行試驗，包括肺癌、乳癌、結腸癌、腎臟癌、卵巢癌、胰臟癌及皮膚癌。GTI-2501是20 mer反義寡核苷酸相對位于RRM1的編碼區。試管研究發現GTI-2501會降低RRM1 mRNA和蛋白的含量。此外，GTI-2501會抑制人類肺癌、肝癌、卵巢癌、腦癌、黑色素瘤、乳癌、 胰臟癌細胞的成長。生物體研究也發現GTI-2501明顯抑制裸鼠的結腸癌、胰臟癌、肺癌、乳癌、腎臟癌、卵巢癌、黑色素瘤、星形膠質母細胞瘤的生長。以GTI-2501治療人類乳腺癌和小白鼠腎腫瘤會造成腫瘤完全消退。GTI-2501可抑制裸鼠黑色素瘤細胞轉移到肺部并延長裸鼠淋巴瘤的存活率。這些結果說明GTI-2501可作為選擇性和特定的抗癌劑[48]。Shibata等[49]針對末期轉移腫瘤，使用RRM2抑制劑GTI-2040聯合奧沙利鉑和卡培他濱，進行第一期臨床試驗，認為這是可行的治療方法。

Klisovic等[50]針對成人復發/難治性急性髓細胞白血病，使用RRM2反義：GTI-2040，抑制RRM2，聯合高劑量阿糖胞苷進行第一期臨床試驗。2001年Orr等[51]以GTI-2040進行第一/二期臨床試驗，并針對腎臟癌和大腸癌作為單一治療藥劑進行第二期臨床試驗。但在2008年Stadler等[52]針對腎臟癌病患，使用GTI-2040和卡培他濱進行第一/二期臨床試驗，因為RRM2在細胞中的表達出現變異的數據，認為還需進一步研究。Leighl等[53]針對末期NSCLC，使用GTI-2040聯合多西他賽進行第一/二期臨床試驗，發現結果并不優于以前單獨使用多西他賽治療NSCLC。

Aye等[54]在試管內針對3種哺乳類細胞株研究，發現Triapine可以在30 min內直接對p53R2內鐵螯合，使p53R2失去活性。Mortazavi等[55]以Triapine長期灌注和固定劑量吉西他濱聯合應用于末期固體腫瘤，進行第一期臨床試驗，探討Triapine最大耐受劑量、安全性、藥代動力學、藥效學和有效性，結果發現在30例病患中，有1例部分反應，15例病況穩定。而Triapine已在進行第二期臨床試驗[54]?？傊?，有關RR抑制劑的研究，目前學者不管在基礎或臨床的研究都持續在努力，期待對癌癥治療提供另一種有利的選擇。

4 展望

RR的研究，經由基礎研究對結構分子的了解，到研究探討大次級單位（RRM1）、小次級單位（RRM2、p53R2）和各類癌癥的相關性，到RR抑制劑（包括如化療制劑：羥基脲、吉西他濱；鐵螯合劑：Triapine；以及反義寡核苷酸：GTI-2501和GTI-2040），進行臨床前期的第一/二期試驗的系列研究，為人類提供一條對抗癌癥可行的路徑。RR可作為抗癌的標定物，因為它是DNA合成和修補的關鍵分子；在許多腫瘤和細胞株的研究中發現它常會增加表達并增加酶的活性；會和一些已知的致癌基因（v-fms, v-src, A-raf, v-fes, c-myc, ODC）一起作用促成細胞轉型和癌化潛能；已知RRM2具有抗癌作用；RRM2表達增多會促使癌細胞具有侵犯潛能；RR表達增多具有抗藥性，這些研究的結果讓人類對抗癌癥充滿期待。尤其最近以納米粒子作為RR的siRNA的運送方式正方興未艾。而有關RR抑制劑，目前仍有一些問題需要解決，包括半衰期太短、藥物抑制太快、本身有部分被抑制、會有可逆性的結合現象等，相信經由學者和臨床研究的攜手合作，許多問題都可以逐漸理清，為人類對抗癌癥的努力做出貢獻。