自噬對低氧微環境中人肺腺癌A549細胞放療敏感性的影響

李勇 徐麗瑤 蔡阿橋 李麗芳 鐘小軍

放射治療是肺癌綜合治療的重要手段之一，如何減少放療抵抗、增加放療敏感性已成為國內外研究的熱點[1]。低氧是肺癌等實體瘤微環境的基本特征，也是導致肺癌對放療產生抵抗的原因之一，低氧可誘導肺癌細胞自噬的發生。近年研究[2,3]表明，自噬可增加乳腺癌、惡性腦膠質瘤放療抵抗。然而低氧環境中自噬是否影響肺癌的放療治療效應目前尚未完全明確。本研究通過觀察γ射線對低氧環境中不同自噬水平A549細胞的殺傷作用，初步分析保護性自噬對A549細胞放療敏感性的影響，為探討自噬對非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）放療敏感性的影響的分子機制奠定前期基礎。

1 材料與方法

1.1 材料 RPMI-1640培養基、胎牛血清（Hyclone）；蛋白提取試劑盒（Pierce公司）；MTT粉（上海生物工程技術服務有限公司）；3-甲基腺嘌呤（3-methyladenine，3-MA，美國Sigma公司）；PCR儀（ABI公司）；三氣培養箱（SANYO公司）；蛋白電泳儀、電轉儀（Bio-Rad公司）；透射電子顯微鏡（日本JEM-2100）；直線加速器（西門子公司）。

1.2 細胞培養及實驗分組

1.2.1 細胞培養 人肺腺癌A549細胞（購于中科院上海細胞庫），用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養基于37oC、5%CO2/95%空氣（常氧）飽和濕度培養箱常規傳代培養。取生長狀態良好的A549細胞經0.25%胰酶消化后，根據后續實驗的不同，分別接種于60 mm培養皿、6孔板及96孔板中培養12 h。更換新鮮培養基后置于37oC、1%O2/5%CO2/94%N2三氣培養箱中，繼續后續實驗。

1.2.2 實驗分組 ①低氧對照組；②低氧+3-MA（5 mmol/L）組。

1.3 電鏡下觀察自噬體的變化 取接種于60 mm培養皿中的A549細胞，加入3-MA（5 mmol/L）處理后繼續低氧培養，分別于0 h，24 h，48 h用不含EDTA的胰酶消化細胞，PBS洗3次，加入新配的4%多聚甲醛，4oC過夜。然后將細胞沉淀放入1%的四氧化鋨中，室溫固定1 h，經一系列脫水及包埋后，固定于銅網上用電鏡觀察。

1.4 Western blot檢測LC3蛋白的表達 取接種于6孔板中的A549細胞， 3-MA（5 mmol/L）處理后低氧培養，于48 h收集低氧組及低氧+3-MA組的細胞，冷PBS洗2次，加入細胞裂解液于4oC裂解20 min，12,000 r/min離心20 min，收集上清，提取細胞總蛋白，BCA法測蛋白濃度。取20 μg樣品煮沸變形后進行Tricine-SDS-PAGE電泳，轉膜，5%脫脂奶粉37oC封閉2 h，一抗4oC孵育過夜，洗膜，二抗37oC孵育1 h，ECL法顯影，分析條帶灰度值，以目的條帶與β-actin調對灰度比值來表示蛋白相對表達量。

1.5 MTT法檢測細胞增殖活性的變化 取接種于96孔板中的A549細胞，加入3-MA處理24 h后給予分別給予0 Gy、2 Gy、4 Gy、6 Gy、8 Gy、10 Gy射線照射，繼續培養24 h。每孔加入MTT 20 μL，作用4 h，吸去培養液，加入二甲基亞砜（DMSO）150 μL，震蕩10 min，于490 nm波長測定吸光度。計算細胞相對抑制率=（1-OD實驗組/OD對照組）×100%，細胞相對存活率=1-相對抑制率。

1.6 統計學分析 采用SPSS 13.0統計軟件進行分析，數據以Mean±SD表示，采用t檢驗分析組間差異，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 3-MA對低氧狀態下A549細胞的自噬水平的影響 隨著低氧培養時間延長（0 h、24 h、48 h），A549細胞中自噬體形成逐漸增加；給予自噬抑制劑3-MA后，A549細胞自噬體增殖明顯減少（圖1），表明3-MA可抑制低氧狀態下A549細胞的自噬活性。

2.2 3-MA對缺氧狀態下A549細胞中自噬標記蛋白LC3蛋白表達的影響 LC3有兩種存在形式（LC3I、LC3II），前體LC3合成后經加工形成LC3I，后者與自噬體膜上的磷脂酰乙醇胺結合形成LC3II。當自噬形成時LC3I會減少而LC3II會增加。經圖像半定量分析灰度值（圖2），低氧組+3-MA組和低氧組LC3-I/β-actin灰度比值分別為0.71±0.03和0.51±0.01，兩組差異有統計學意義（P＜0.05）；LC3-II/β-actin灰度比值分別為0.42±0.02和0.86±0.01，差異有統計學意義（P＜0.05）。結果顯示，與低氧組相比，低氧+3-MA組LC3II表達水平下調，LC3I表達水平上調，LC3II/LC3I比值下降，表明3-MA可有效抑制缺氧狀態下A549細胞的自噬標記蛋白的表達。

2.3 低氧微環境下A549細胞自噬活性對放療敏感性的影響 低氧狀態下，放療+3-MA組中A549細胞增殖活性較單純放療組下降（P＜0.05）（表1），表明采用自噬抑制劑3-MA下調A549細胞自噬活性后，能增強A549細胞的放療敏感性。

3 討論

自噬是細胞為適應營養或生長因子缺乏、低氧、內質網應激等有害刺激所發生的一種應激反應[4]。在氧供不足或營養缺乏時，腫瘤細胞可通過自噬緩解細胞的代謝壓力，克服營養缺乏和低氧環境得以生存[5]；同時，自噬可選擇性地清除某些細胞成分，如受損或多余的氧自由基、DNA、過氧化物酶體、內質網、線粒體等，減少異常蛋白、細胞器的堆積，以維持細胞自我穩態[6]。自噬作為一種防御機制，在應激狀態下，特別是缺氧條件下對維持腫瘤細胞存活、逃避凋亡具有重要作用。

放射治療是腫瘤最重要的治療手段之一，然而卻因腫瘤的放療抵抗而易導致腫瘤的復發和殘留。研究發現抑制腫瘤細胞的自噬水平可影響放療敏感性。Ito等[3]證實，與單純放療組相比，放療聯合自噬抑制劑（3-MA和巴佛洛霉素A）可明顯增加惡性腦膠質瘤U373-MG細胞DNA雙鏈斷裂損傷。Chaachouay等[2]則證實，與乳腺癌放療敏感細胞株HBL-100相比，乳腺癌放療抵抗細胞株MDA-MB-231自噬活性明顯增強，采用自噬抑制劑（3-MA和氯喹）預處理MDA-MB-231細胞，可明顯抑制其增殖活性，減少其放療抵抗。自噬與肺癌亦關系密切。Kim等[7]使用自噬抑制劑如caspase-3抑制劑（ZDEVD）和mTOR抑制劑（RAD001）能使NSCLC H460細胞增殖活性下降，凋亡增加，從而明顯增強H460細胞的放射敏感性，同時在小鼠荷瘤模型中觀察到，放療分別聯合Z-DEVD或RAD001，生存期較單純放療組分別延長3 d和5 d 。

圖1 低氧狀態下3-MA處理后A549細胞自噬體的變化（×6,000）Fig 1 The change of autophagosome in A549 cells after treatment with 3-MA in hypoxia condition. A: hypoxia 0 h group； B: hypoxia 24 h group；C: hypoxia 48 h group； D: hypoxia plus 3-MA 0 h group； E:hypoxia plus 3-MA 24 h group；F: hypoxia plus 3-MA 48 h group.

圖2 低氧48 h后兩組A549細胞中自噬標記蛋白LC3的表達變化Fig 2 The expression changes of LC3 protein in A549 cells after hypoxia for 48 h

表1 低氧培養后不同放射劑量下自噬對A549細胞存活的影響Tab 1 The effect of autophagy on the viability of A549 cell after treatment with different radiotherapy doses in hypoxia condition

可見，自噬調節聯合放療有望成為腫瘤治療的新策略。但目前有關肺癌與自噬關系的研究，絕大多數局限于在常氧狀態下，而在低氧微環境中，自噬影響肺癌細胞放療敏感性的研究目前僅見零星報道。

由于肺癌等實體腫瘤在發生發展過程中，細胞的快速生長、氧耗增加，加之血管新生紊亂，腫瘤內部常處于低氧狀態。低氧可增加放療抵抗而使腫瘤更具有侵襲性[8]，但其具體機制未明。研究表明低氧可誘發細胞自噬的發生。為了更好地模擬腫瘤生長的體內微環境，探討自噬對低氧微環境中人肺腺癌A549細胞放療敏感性的影響，課題組建立了低氧培養條件，采用肺腺癌A549細胞為研究對象，觀察不同自噬活性下A549細胞對放療射線的敏感性。

本研究通過觀察自噬體的數量及檢測LC3的表達、分析LC3II/LC3I比值變化來判斷細胞的自噬活性。LC3蛋白是自噬體膜上標志性蛋白，是反映自噬活性較特異的指標。研究[9]報道，5 mmol/L 3-MA可抑制常氧環境中胃癌BGC-823細胞自噬水平，本研究證實給予3-MA（5 mmol/L）處理后，低氧環境中A549細胞自噬體數量減少，LC3II/LC3I比值下降，這表明3-MA（5 mmol/L）亦可成功抑制低氧環境中A549細胞自噬的發生。此外，本研究還發現，在不同劑量放療照射同時給予3-MA處理A549細胞，細胞相對存活率較單純放療組均有不同程度的下降。表明采用3-MA抑制自噬可增強A549細胞放療敏感性，但其具體分子機制尚不明確，分析可能與3-MA通過抑制bcl-2表達使腫瘤細胞凋亡增加以及3-MA通過抑制PI3K/AKT途徑進而阻斷COX2誘導的凋亡抵抗[10]有關，尚有待于進一步實驗證實。

文獻[11]報道，3-MA可影響腫瘤細胞增殖，且呈劑量依賴性 。本實驗未放療組（0 Gy組）結果顯示，3-MA（5 mmol/L）處理細胞后其相對存活率較對照組呈下降趨勢，但無統計學差異，考慮本實驗單一劑量3-MA并未完全反映其對A549細胞增殖的影響。本研究選用3-MA（5 mmol/L）在有效抑制細胞自噬的同時，其對細胞增殖影響甚微，表明3-MA對A549細胞的放療增敏作用是通過抑制細胞自噬水平實現的。此外，不同濃度3-MA對A549細胞自噬及放療敏感性是否有影響，尚有待進一步實驗明確。本研究結果為后期探討自噬對NSCLC放療敏感性的作用的分子機制奠定了前期基礎。