異種移植抗原α-gal介導人血清殺傷A549細胞的實驗研究

朱圣明 謝玲 鄭鴻 秦鳳 劉美 駱志國 王艷萍

近年來，以利妥昔單抗和曲妥珠單抗為代表的治療性單抗藥物的開發和應用成為腫瘤分子靶向治療領域最為成功的代表，該類藥物以腫瘤相關抗原（tumor associated antigen, TAA）作為分子靶標，通過與抗原結合，介導補體依賴的細胞毒性作用、抗體依賴的細胞毒性等多種機制殺傷腫瘤細胞[1-3]。然而，至今正式應用于臨床治療的治療性單抗藥物多集中在血液系統腫瘤、乳腺癌和大腸癌等少數腫瘤。其重要原因在于選擇合適的靶抗原是成功設計與開發腫瘤治療性單抗的前提和關鍵，而目前除了少數腫瘤之外，大部分腫瘤尤其是高復發率腫瘤的TAA很難明確，即便是在TAA較清楚的少數腫瘤，由于腫瘤細胞間存在的異質性和腫瘤患者個體差異性使得針對TAA單抗藥物的開發和應用受到了限制[4]。隨著分子生物學技術的飛速發展，一些腫瘤研究者開始嘗試通過基因治療手段，重新在人腫瘤細胞上合成人類不表達的異種抗原，利用人體天然存在的免疫體系，誘導了一系列有效的抗腫瘤效應，顯示出良好的應用前景。

α-gal是廣泛存在于豬、牛、鼠等非靈長類哺乳動物體內的一類碳水化合物表位。在物種進化的過程中，由于負責催化合成α-gal的半乳糖基轉移酶基因的移碼突變和無意義突變，人體不能合成α-gal，但人體天然預存著大量針對α-gal的抗體，這些抗體能特異性識別并結合外源性α-gal表位。移植免疫學研究證實[5]，誘發豬-人器官移植過程中超急性免疫排斥反應的關鍵因素正是在于，表達在豬血管內皮細胞上的α-gal能同人體天然存在的α-gal抗體迅速結合，通過CDC途徑引起移植物細胞的溶解和血管內皮細胞的損傷。這提示，利用α-1,3GT的基因導入，在腫瘤細胞上重新合成α-gal，構建能被人體天然抗體識別且特異性結合的異種靶標，有可能介導類似于異種移植排斥反應的抗腫瘤效應。本研究通過轉基因手段建立穩定表達異種移植抗原α-gal的人肺癌細胞系，探討α-gal誘導的人血清抗體/補體系統免疫激活機制，以期為腫瘤生物治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 人肺癌細胞系A549、人胚肺成纖維細胞MRC-5和已知α-gal陽性表達的豬髂動脈內皮細胞PIEC均由四川大學華西醫院腫瘤分子診斷實驗室提供，用含有15%新生小牛血清的DMEM培養基培養。pEGFP-N1-GT[6]是CMV啟動子調控的α-1,3GT基因表達質粒為本課題組在前期工作中構建。DMEM培養基、脂質體轉染試劑盒lipofectamineTM2000、Trizol總RNA提取試劑盒購自Invitogen公司。熒光素標記的植物凝集素（FITC-BSIB4）為Vector公司產品。M-MLV逆轉錄酶、新霉素衍生物G418購自美國Promega公司。高保真DNA聚合酶KODPlus DNA polymerase購自日本Toyobo公司。MTT購自美國Sigma公司。熒光素標記的羊抗人IgM（FITC-anti-IgM）及羊抗人C3（FITC-anti-C3）均購自北京中杉金橋公司。健康人混合型血清為四川大學華西醫院中心血庫提供。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養 37oC、5%CO2條件下，用含10%小牛血清的DMEM常規培養人肺腺癌細胞A549、MRC-5和PIEC細胞。

1.2.2 質粒轉染和穩定轉染細胞株的篩選 將對數生長期細胞A549細胞接種于6孔板中，24 h后細胞長至80%-90%時，按照lipofectamineTM2000說明書將pEGFP-N1-GT轉染A549細胞。48 h后，將轉染細胞以1:5傳代，同時換用400 mg/mL的G418細胞篩選培養基，G418的濃度隔日增加100 mg/mL，維持G418濃度為800 mg/mL至3周后形成單克隆；共挑取10個克隆擴大培養，并間歇給予400 mg/mL的G418，在此期間，每月利用直接熒光免疫染色法檢測細胞表面α-gal的表達，經篩選得到的穩定表達α-gal的A549細胞命名為A549-GT。下述實驗均采用轉染24個月后的A549-GT細胞，并將A549細胞作為其母本對照組，將無啟動子的空質粒轉染細胞A549-p1-GT，作為平行對照組。

1.2.3 α-1,3GT基因mRNA的表達檢測 按照Trizol總RNA提取操作方法，提取轉染細胞總RNA。以總RNA為模板，利用RT-PCR的方法檢測上述細胞中α-1,3GT mRNA的表達。根據GenBank中豬α1,3-GT的序列（NM_213810）及內對照（人GAPDH）的序列設計引物，F1：5'-TCAATGCTGCTTGTCTCA -3，R1：5'-TAAGTGCCTTCCCATA-3'（擴增300 bp的α-1,3GT片段）；F2：5'-GTCAGTGGTGGACCTGACCT-3'，R2：5'-AGGGGAGATTCAGTGTGGTG-3'（擴增395 bp的GAPDH片段）逆轉錄后，PCR條件為94oC預變性2 min，94oC 30 s，50oC 30 s，72oC 2 min，33個循環，72oC后延伸10 min。RT-PCR產物用15 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.4 A549-GT細胞上α-gal抗原表位的表達檢測 植物凝集素（BS-IB4 lectin）能與α-gal特異性結合，故本實驗采用熒光素標記的凝集素（FITC-BS-IB4 lectin）檢測96孔板轉染細胞中α-gal的表達。在96孔板中接種細胞，用DMEM培養液以1:50稀釋BS-IB4 lectin，向每孔加入50 μL稀釋液，室溫避光20 min。在熒光倒置顯微鏡下每月1次檢測細胞上α-gal的表達情況。流式細胞儀檢測：另取一定數量細胞分至EP管中，1%BSA洗細胞3次；每4×105細胞加入含8 μg BS-IB4lectin的1%BSA液300 μL，4oC避光1.5 h；1%多聚甲醛固定，4oC避光30 min；1%BSA洗3次；加入300 μL 1%BSA，重懸，上機檢測，以A549細胞為陰性對照，每組重復3次。

1.2.5 α-gal在A549-GT細胞膜上的穩定性檢測 取6孔板，在同一孔中接種105個A549-GT和105個MRC-5細胞，常規培養24 h；另取一孔，接種105個MRC-5細胞，12 h后，PBS清洗細胞，將培養瓶中A549-GT細胞培養液稍加離心后，上清加入MRC-5細胞中，繼續培養24 h。按1.2.4方法，熒光顯微鏡觀察細胞表面α-gal的表達情況。

1.2.6 A549-GT與血清IgM和血清補體C3結合分析

1.2.6.1 熒光顯微鏡下觀察轉染細胞與人血清中IgM的結合情況 在96孔板中接種細胞，PBS洗3次。以下過程均在4oC下進行。2%多聚甲醛固定10 min。PBS洗3次。每孔加入人血清100 μL，4oC靜置1 h。吸去血清，PBS洗3次。每孔加入50 μL用DMEM液按1:50稀釋的羊抗人FITC-anti-IgM，靜置30 min，PBS洗3次。以A549細胞為陰性對照，熒光倒置顯微鏡下觀察人血清中IgM與細胞的結合情況。

1.2.6.2 流式細胞儀檢測轉染細胞與人血清中IgM的結合情況 消化細胞分至EP管中，1%多聚甲醛4oC固定細胞30 min；1%BSA洗2次；加入用DMEM稀釋的80%的人血清300 μL，懸浮細胞，37oC，1 h；1%BSA洗3次；用DMEM按1:50稀釋羊抗人FITC-anti-IgM，按每1×106細胞加入稀釋液200 μL，4oC，避光靜置30 min。1%BSA洗3次；加入300 μL 1%BSA，重懸細胞，上機檢測，以A549細胞為陰性對照，重復3次。

1.2.6.3 分別參照步驟1.6.1和1.6.2中轉染細胞與血清IgM結合的分析方法，將羊抗人FITC-IgM改為羊抗人FITC-anti-C3，利用熒光顯微鏡和流式細胞儀檢測轉染細胞與血清補體C3的結合情況。

1.2.7 細胞生長曲線和細胞形態觀察 按1×104個/孔在96孔板上接種A549、A549-G、A549-p1-GT細胞，每種細胞設置5個復孔。5%CO2、37oC培養。分別在細胞接種24 h、48 h、72 h、96 h、120 h、144 h后取上述96孔板中細胞，每孔加入10 μL MTT（5 mg/mL），37oC繼續培養4 h；去上清后每孔加入DMSO150 μL，570 nm波長檢測OD值；統計學處理所測得數據。以時間為橫坐標，OD值為縱坐標，繪制生長曲線。培養過程中，光鏡下觀察A549、A549-G細胞的形態。

1.3 統計學分析 采用SPSS 11.0進行統計學分析，以P＜0.05為有統計學意義。

2 結果

2.1 A549-GT 中α-1,3GT mRNA的表達 RT-PCR瓊脂糖凝膠電泳分析顯示：轉基因細胞系A549-GT細胞中有α-1,3GT mRNA的表達，而A549細胞及空質粒轉染細胞A549-p1-GT則無（圖1），細胞傳代24個月后重復實驗仍能得到同樣的結果。

2.2 A549-GT細胞中α-gal的表達 直接免疫熒光染色法觀察結果顯示：A549-GT和PIEC細胞中有較強的熒光，A549細胞中無熒光（圖2）；FCM分析顯示：穩定轉染24個月后A549-GT陽性表達細胞達（80.1±3.2）%，陽性對照細胞PIEC上α-gal的表達率達80%，對照組母本細胞A549的陽性細胞百分比僅（1.1±0.8）%。

圖1 A549-GT細胞中α-1,3GT mRNA的表達Fig 1 The expression of α-1,3GT mRNA in A549-GT cells. M: marker；1-4: A549-GT； 5,6: A549； 7,8: A549-p1-GT.

圖2 A549-GT細胞中α-gal表達免疫熒光觀察（×200）及流式細胞分析Fig 2 Immunofluorescence observation and FCM analysis of the expression of α-gal on A549-GT. A: A549； B: PIEC； C: A549-GT.

圖3 α-gal的表達對A549轉基因細胞形態（×100）及增殖的影響Fig 3 The effects of α-gal on the morphology and proliferation of A549 transfected cells. N: A549-GT； a: A549.

2.3 A549-GT的細胞生物學特性 在常規培養上述細胞的過程中，顯微鏡下觀察到：穩定表達α-gal的A549-GT細胞與A549細胞之間細胞形態沒有明顯差異。MTT檢測穩定表達α-gal的A549-GT細胞生長情況，生長曲線結果（圖3）顯示，A549細胞及空質粒轉染細胞A549-p1-GT和A549-GT細胞增殖速度無統計學意義（P＞0.05）。

2.4 α-1,3GT對周圍正常細胞的影響 A549-GT細胞與MRC-5共培養以及A549-GT培養基與MRC-5共培養24 h后，植物凝集素的直接免疫熒光結果顯示：兩種培養方式均只在A549-GT細胞上觀察到熒光，MRC-5細胞無熒光（圖4），說明α-1,3GT牢固地錨定在轉基因細胞內，對周圍正常細胞未產生“旁觀者”效應。

2.5 A549-GT細胞與血清IgM和血清補體C3的結合 細胞經健康人血清處理，再與FITC-anti-IgM共同孵育后，熒光倒置顯微鏡下觀察到：表達α-gal的A549-GT細胞膜上有大量的熒光，而不表達α-gal的A549細胞膜上則僅見本底性結合（圖5）。FCM分析結果顯示：A549和A549-GT經血清處理后細胞膜上檢測到的平均熒光強度分別為4.68±0.22、45.9±0.46。細胞經人血清處理，與FITC-anti-C3共同孵育后，熒光倒置顯微鏡下觀察到：A549-GT細胞膜上有大量FITC-anti-C3的沉積，而A549細胞膜上則僅見本底性結合（圖5）。FCM分析結果顯示：A549和A549-GT經血清處理后細胞膜上檢測到的平均熒光強度分別為4.5±0.17、37.5±0.36。

3 討論

α-gal（Galα-1,3Gal-β1-4-GlcNAc-R）是細胞表面糖蛋白和糖酯上Galα(1-3)Gal雙糖末端殘基結構，廣泛表達于除人、猿和古世紀候之外的哺乳動物細胞表面，是由α-1,3半乳糖基轉移酶（α-1,3GT）負責催化合成。在生物進化過程中，由于基因突變，α-1,3GT功能失活，不能合成α-gal。Lanteri等[7]克隆了人α-1,3GT基因并與小鼠α-1,3GT基因做比對，結果證實，兩者在基因結構上具有相似性，但由于強轉錄終止信號的提前出現，使得人α-1,3GT mRNA只轉錄出4個截短的外顯子區，而缺失了兩個具有催化功能的外顯子區，這導致了人截短的、無功能的α-1,3GT假基因的形成。本研究，將前期建成功的CMV啟動子調控的α-1,3GT基因真核表達載體pEGFPN1-GT轉染A549后，RT-PCR顯示正常人肺腺癌細胞A549中無α-1,3GT基因表達，而轉基因細胞A549-GT中有大量α-1,3GT mRNA轉錄產物。植物凝集素（BS-IB4）具有與α-gal表位特異結合的特點，植物凝集素標記下的直接免疫熒光染色法和流式細胞術均檢測到A549-GT細胞中有豐富的α-gal合成，而A549中無α-gal合成，這提示人體因α-1,3GT假基因的存在不表達α-gal，但有可能利用基因導入的方法，將外源性α-1,3GT基因導入人腫瘤細胞，重新在腫瘤細胞上合成α-gal。國內外也有一些研究者借助基因重組技術，首先通過昆蟲、病毒和細菌等生物容器中獲取a-1,3GT，再用神經氨酸酶處理腫瘤細胞，最后與尿苷二磷酸半乳糖（UDP-Gal）共孵，在腫瘤細胞表面合成α-gal表位，但這些方法不僅步驟繁瑣、產量不高，且在人體應用過程中，殘留的病毒蛋白和細菌內毒素可能給患者帶來不必要的損傷[8-10]。

圖4 α-1,3GT對周圍正常細胞的影響Fig 4 The effect of α-1,3GT on normal cell

圖5 熒光顯微鏡觀察及流式細胞分析A549-GT細胞與血清中IgM/C3的結合Fig 5 The binding of A549-GT on IgM/C3 by fluorescence microscope and FCM

為探討α-gal表位在腫瘤細胞中的重新合成對腫瘤細胞生物學特性的影響，本研究通過MTT增殖實驗比較了轉基因細胞A549-GT及其親本細胞A549的增殖活性，結果未發現明顯差別。與本研究結果一致的是，Xing等[11]發現在胃癌細胞、黑色素瘤細胞和人肺癌細胞上合成α-gal改變了細胞表面能與VVA，PNA等相互作用的碳鏈結構，而腫瘤細胞的生長速度并沒有受到明顯的影響。Aubert等[12]報道，表達α-gal的胰腺癌細胞Bx-αGT.9和PcαGT.2與其母本細胞的生長速度沒有明顯差別，但卻修飾了細胞表面碳鏈結構，改變了細胞表面其它與腫瘤細胞生物學特性相關的碳水化合物殘基結構，可能會改變胰腺癌癥細胞之間及同周圍基質的粘附能力，甚至降低胰腺癌細胞的轉移能力。隨后，研究者利用金倉鼠細胞系HaP-T1做了類似的研究，結果得到相同的結論[13]。

α-1,3半乳糖苷基轉移酶位于細胞高爾基體，為一典型的II型跨膜蛋白，包含一短的胞質尾區、一跨膜區、一主干區和一個羧基末端催化區，有學者以可溶形式表達了α-1,3GT截短的催化結構域，同樣可以在腫瘤細胞表面合成α-gal表位[10]，但若將這種可溶的α-1,3GT用于人腫瘤治療，則可能使得周圍的正常細胞產生“旁觀者”效應，本研究將α-1,3GT全長基因克隆至表達載體，不僅能在腫瘤細胞上長期穩定合成α-gal，而且轉基因細胞及其培養基分別與正常人胚肺成纖維細胞MRC-5共培養，均不能使MRC-5獲得α-gal合成能力，這說明α-1,3GT在轉基因細胞內的錨定具有牢固性，不會輕易脫落“感染”周圍正常組織，增加了其應用于人體時的靶向性。此外，本研究發現，α-1,3GT酶活性穩定，轉基因細胞24個月后仍能大量合成α-gal表位，且α-gal未被人體其它酶類消化掉，保證了其穩定性和有效性。

雖然人體不能合成α-gal表位，但正如遠古時代人類祖先能對表達α-gal的感染性微生物產生防御一樣，人類對α-gal并不耐受，作為對棲身于胃腸道且表達α-gal的微生物的免疫應答，正常人從嬰兒開始，由占循環總量1%的B淋巴細胞產生大量針對α-gal的天然抗體（anti-gal），包括IgG、IgM和IgA[14]。已有的研究[15]表明：由于α-gal表位缺乏唾液酸且完全沒有靜電電荷，anti-gal抗體對α-gal的結合具有非常高的特異性，它只能結合到細胞表面糖脂的α-gal殘基上，而不能結合到哺乳動物細胞表面其它碳水化合物表位上[16]。異種器官移植免疫研究顯示，導致移植物超急期排斥反應的主要機制是人血清中抗α-gal抗體與豬組織細胞上α-gal特異性結合，激活了補體系統，在移植物細胞膜上形成膜攻擊復合體，裂解表達α-gal的豬組織細胞，導致器官移植失敗。為此，國內外一些研究者正積極尋求克服這種排斥反應的有效手段，如培育α-1,3GT基因敲除豬等[17]。本研究反向思維，通過基因導入手段在人腫瘤細胞上重新合成了α-gal表位，以期模擬HAR機制發揮抗腫瘤作用。在本實驗中，分別向A549-GT和A549細胞中加入正常人血清，再與熒光素標記的抗IgM抗體（FITC-anti-IgM）共孵育后，熒光顯微鏡及流式細胞術均檢測到轉基因細胞A549-GT細胞膜上有大量anti-gal抗體結合，而A549細胞膜上則無結合，且人血清天然抗體對腫瘤細胞的結合依賴于腫瘤細胞上α-gal的表達。

Aubert等[13]發現，表達a-gal的Bx-aGT9和PC-aGT2細胞不僅能引起anti-gal抗體與之結合，還能進一步誘導與之結合的anti-gal抗體上補體因子的大量結合。為進一步證實表達a-gal的肺癌細胞與血清抗體結合后能否激活補體系統，本研究將A549-GT細胞和正常人血清共同孵育，熒光素標記的補體結合實驗顯示：穩定表達α-gal的A549-GT細胞膜上有大量補體C3的結合，而不表達α-gal的A549細胞膜上則未見熒光。這提示，利用基因轉導手段向人肺癌細胞中導入功能性α-1,3GT基因，為人血清中天然抗體攻擊腫瘤細胞構建特異性靶標，可能誘導血清抗體的結合及補體的激活，進而發揮抗腫瘤效應。Unfer的研究小組[18]將表達a-gal的MC38細胞與人血清共同孵育，補體依賴的細胞毒殺傷實驗顯示：與50%人血清共同孵育的表達a-gal的MC38細胞有98%被裂解。Yoshimura等[19]在肝癌和胰腺癌細胞上觀察到同樣的現象。郭軍[20]的研究報道，將穩定表達α-gal的胃癌細胞株GC9811與不同濃度的人血清孵育后，觀察到GC9811細胞能被不同濃度的血清有效的裂解，且裂解作用具有血清濃度依賴性。

和其它腫瘤自殺基因、凋亡基因用于腫瘤基因治療一樣，將α-1,3GT基因導入腫瘤細胞中也需面臨靶向性問題，假設α-gal抗原在腫瘤之外的正常組織中表達，不僅會產生類似異種器官移植的強烈排斥反應，使正常組織受到損傷，還會增強正常人體細胞的免疫原性，引起嚴重的自身免疫性疾病，如Graves'病等[21,22]。因此，積極探索靶向性更強的基因表達方式是開發α-gal用于腫瘤基因治療必須解決的難題之一。但國內外的大多數研究者似乎并沒有對這種嚴重后果給予足夠的重視。Lanteri的課題組將長約250 bp的neu基因啟動子驅動α-1,3GT基因在C-erb高表達的乳腺癌細胞中靶向表達α-gal表位[23]。在前期工作中，課題組成功構建hTERT啟動子調控α-1,3GT基因的真核表達載體，實現了α-1,3GT基因在肺癌細胞中靶向合成α-gal。在本研究中，我們發現通過基因導入手段能夠使α-1,3GT持續、穩定地在腫瘤細胞上合成α-gal。然而，hTERT啟動子活性相對較弱，如何將有效性與靶向性完美的結合是今后研究的一個方向，將增強子和hTERT啟動子聯合、CMV/SV40啟動子和hTERT啟動子聯合，或者合成人工hTERT啟動子可能是較好的思路之一[24,25]。

總之，本實驗通過基因導入手段將異種移植抗原α-gal引入到腫瘤細胞上，觀察到了人血清處理后抗體/補體系統的激活，這為腫瘤生物治療提供了全新的思路，但α-gal誘導的人血清抗腫瘤效果及靶向性問題都需要進一步的研究和探討。