布魯氏菌的致病機制與細胞免疫機制研究進展＊

董炳梅，王金良，唐 娜，苗立中，沈志強，

布魯氏菌病是由布魯氏菌（Brucella spp．，Bru）感染引起的一種嚴重人獸共患傳染病，人在接觸患病動物或被污染的動物產品后即可發病，世界上每年布魯氏菌病發病人數超過50萬［1］。Bru是一種兼性細胞內感染細菌，菌體表面最主要的抗原是脂多糖（LPS）和外膜蛋白等，其感染的靶細胞主要是巨噬細胞與胎盤滋養層細胞，但也可在樹突狀細胞（dendritic cell，DC）中生長繁殖。該菌不僅具有抵抗吞噬細胞殺菌作用的能力，并可阻止抗原特異性T細胞對其識別，從而形成有利于其生存和繁殖的微環境，導致慢性持續感染［2－3］。該病主要以Th1型細胞免疫應答為主，由DCs誘導的細胞免疫應答在機體抗Bru感染中發揮著重要作用。本文在分析Bru主要抗原分子生物學特性的基礎上，就Bru的致病機制及巨噬細胞與DCs參與的機體抗Bru過程的研究進展作一綜述。

1 布魯氏菌主要抗原的分子生物學特性

Bru的細胞膜結構可分為3層，從內層到外層依次為細胞質膜、外周胞質膜與外膜。外膜與肽聚糖（peptidoglycan，PG）層緊密結合組成細胞壁，含有LPS、蛋白質和磷脂層［4］。Bru 細胞膜中含有的LPS和外膜蛋白等，與細菌的毒力及免疫原性密切相關。近年來隨著研究的深入，越來越多的相關抗原及其作用機制被發現證明，在此僅對Bru引起免疫應答的主要抗原做一簡要介紹。

1．1 脂多糖 LPS是革蘭氏陰性菌的主要表面成分，被認為是炎癥應答與免疫調節的激活劑，目前革蘭氏陰性菌的脂多糖幾乎與內毒素一詞成為同義詞。但是與大腸桿菌等腸道菌群具有的經典LPS有所不同，Bru LPS誘導的人類單核細胞僅釋放了少量TNF－α與IL－1β。確定LPS作為Bru的毒力因子有以下兩個依據：第一，Bru的LPS比腸桿菌科的LPS免疫原性小，因此非化膿性Bru LPS不能明顯激活補體替代激活途徑，對B細胞是一個刺激較小的有絲分裂原，要引起動物致死和誘導產生干擾素，需要的Bru LPS的量是腸桿菌科內毒素量的10倍，因此推測由Bru LPS刺激宿主產生的較小的生物反應，或許是這些病原體在吞噬細胞內存活的一個重要原因。第二，LPS缺陷Bru突變株對補體和多粘菌素B介導的溶菌作用是敏感的。目前，公認光滑型LPS在Bru進入吞噬體的早期表現出重要的作用。最近的研究還表明，Bru2308株的光滑型LPS還潛在地具有維持細菌在宿主巨噬細胞中長期生存的免疫調節活性。

1．2 外膜蛋白 革蘭氏陰性菌的外膜蛋白被證明能夠調節吞噬細胞的功能，能夠激活細胞活素的產生。Bru主要的外膜蛋白在20世紀80年代首次被鑒定具有免疫原性和抗原保護作用［5］。Bru外膜蛋白分組首先由Verstreate等在1982年提出，即將去污劑連續處理抽提法提取的外膜蛋白經SDSPAGE后分為3組：第一組分子量范圍88kD～94 kD，多數菌在94kD出現一條帶，但有的出現在88 kD，此組蛋白有熱穩定性。研究表明，第二組蛋白質其分子量范圍在35kD～40kD。第三組蛋白分子量范圍在25kD～34kD之間，此組蛋白表現為異質性，SDS－PAGE遷移率有所不同。Santos等對牛種、綿羊附睪種、犬種、羊種Bru粗糙型菌株外膜蛋白經SDS－PAGE后分為兩類：一種是粗糙型牛種、綿羊附睪種和犬種Bru，與光滑型牛種Bru一致含有三組主要蛋白質；另一種是粗糙型羊種Bru，在第一組和第二組蛋白質之間多了一條分子量為48kD的帶。Afzal發現綿羊附睪種的第二組蛋白有54kD蛋白質，因此第二組蛋白在數量上是多變的，這可能是由于提取方法不同、菌株變異或不同培養條件等原因造成的。

隨著分子生物學技術的快速發展，大量研究表明，Bru的外膜蛋白有很強的免疫原性，可能與Bru在巨噬細胞內存活有關。目前，分子生物學上研究的Bru主要外膜蛋白有7種［6］，即10kD，16．5kD，19kD，25kD～30kD，31kD～34kD，36kD～38 kD和89kD～94kD。除這些主要外膜蛋白外，已鑒定出的Bru胞蛋白、外周蛋白及一些膜蛋白中也有許多蛋白質具有免疫原性。它們除能夠引起宿主體液反應外，更多的是與Bru在巨噬細胞內存活和抗巨噬細胞殺傷能力有關。

1．3 VirBⅣ型分泌系統 編碼BruⅣ 型分泌系統的操縱子VirB是一種膜相關轉運體（membraneassociated transporter），可以釋放底物分子靶向宿主細胞。Ⅳ 型分泌系統對于Bru抵抗宿主細胞內環境的改變是至關重要的，pH值的改變以及宿主細胞營養物質的減少都會誘導Bru VirB操縱子的表達［7］。研究表明，Bru VirBⅣ 型分泌系統不僅可促進機體Th1細胞免疫應答的產生，而且更加能夠促進Th2體液免疫應答的產生，并加快IgM與IgG的分泌與循環。羊種、豬種、牛種Bru擁有由12種VirB操縱子成分編碼的Ⅳ型分泌系統，能有效地防止吞噬了Bru的吞噬小體與溶酶體的融合，從而阻止Bru被消化，使其能在吞噬細胞中寄生［6］。而且VirB與細菌N型分泌系統同源，該系統分泌的效應分子決定了Bru進入內質網復制相關區。研究表明，VirB1為 Ⅳ 型分泌系統非必需成分，可溶解糖基轉移酶位點，從而使 Ⅳ 型分泌系統更易裝配與集合；VirB1、VirB9與VirB1l的蛋白親和力十分相近，且VirB1具有與VirB9同源性很高的C末端，說明在 Ⅳ 型分泌系統形成過程中，VirB1對其它VirB蛋白的產生具有重要影響。VirB2和VirB5蛋白可能是細菌表面菌毛結構蛋白。VirB5和VirB8可引發吞噬細胞產生酸性吞噬空泡，主要調節Bru的吞噬作用和細胞內的運輸。VirB8在 Ⅳ 型分泌系統中起主要作用，主要是與VirB9和VirB10在細胞膜上形成群體。VirB3、VirB6、VirB7和VirB10蛋白是細菌跨膜蛋白的傳送信號。VirB4有一個完整的 ATP結合區，和VirB11蛋白與VirD4蛋白偶聯使ATP酶從表面跨膜進入細胞質。VirB12可作為一種Bru血清學檢測標記抗原。VirB操縱子可阻止感染了Bru的DCs的成熟，削弱其抗原提呈能力，從而抑制DCs誘導的Th1細胞免疫應答。

2 布魯氏菌致病機制研究進展

Bru是一種革蘭氏陰性、兼性胞內寄生菌，主要以巨噬細胞與胎盤滋養層細胞為宿主細胞。然而研究表明，Bru在兩種宿主細胞中的生存卻依賴截然不同的subsets of genes的產生。在自然宿主、人類、以及試驗動物感染中，由于巨噬細胞表達更多的Bru模式識別受體，所以Bru優先感染巨噬細胞［8］。雖然特異性IgG和巨噬細胞INF－γ的活化促進了巨噬細胞的殺傷能力，但是強毒菌株仍能抵抗細胞殺傷作用，甚至在細胞內大量繁殖，削弱巨噬細胞吞噬功能，使巨噬細胞的細胞殺傷作用與抗原提呈功能部分喪失，從而逃避宿主的免疫防御機制，造成持續感染。

2．1 布魯氏菌侵染巨噬細胞作用機制 Bru經常規吞噬途徑侵入巨噬細胞后，在最初的4h內，80%～90%的細菌被殺死，得以存活的Bru首先定居于酸性環境并立即與早期內吞小體融合，但卻能抑制與晚期內吞小體和溶酶體融合，隨后Bru被轉運至復制吞噬體中（replicative phagosome），復制吞噬體的內環境更有利于布魯氏菌的生存與復制；對復制吞噬體的膜成分的研究表明，含有Bru的空泡在不斷地與巨噬細胞內質網相互作用，表明Bru開始自身復制增殖［9］。當Bru在巨噬細胞的復制吞噬體中由對數生長期發展到穩定階段時，環境會發生改變，其中包括pH值改變、ROIs的作用。此時Bru需要產生對環境改變的持續的抵抗，HF－Ⅰ是一個RNA編碼的蛋白質，在多種細菌復制的穩定階段，對細菌的基因表達發揮了至關重要的作用。另一方面它能促進CydAB的表達與活化，從而保護細菌免遭氧化。另有報道顯示，在 THP－1細胞系中，Bru也可在非酸性吞噬小體中生存，可能是Bru抵抗吞噬小體的酸化，從而導致脫酸作用的結果。另有研究顯示，Bru可通過抑制IFN－γ調節的相關STAT1蛋白與CBP／P300反式作用子的相互作用，從而逃避IFN－γ活化的巨噬細胞殺菌作用。

Bru光滑型LPS可保護細菌免遭補體調節的細胞殺傷作用。在早期階段，Bru通過LPS與巨噬細胞膜表面的脂筏相互作用，從而侵入宿主細胞激活機體的初始免疫應答；隨后，LPS抑制含有Bru的吞噬小體進一步與溶酶體融合，從而避免被降解。最新研究表明，光滑型LPS對Bru在巨噬細胞中的長期生存具有免疫調節作用，一方面它可以與巨噬細胞表面的 MHCⅡ 結合，形成 MHCⅡ－LPS復合物，此復合物可干擾巨噬細胞以 MHCⅡ 的方式提呈抗原，從而削弱巨噬細胞活化抗原特異性CD4＋T細胞；另一方面，它可以阻止感染了Bru的巨噬細胞的凋亡，從而促進其在宿主細胞中的生存與復制。但是巨噬細胞體外感染粗糙型Bru后，經半胱天冬酶－2與NF－κB調節，極大的促進了巨噬細胞的程序性死亡，并伴隨著TNF－α及IL－1β等細胞因子的釋放［10］。Bru外膜蛋白與脂蛋白是誘導機體產生抗Bru免疫應答的重要因素，研究表明，熱殺死的Bru脂蛋白Omp16與Omp19與單核細胞／巨噬細胞TLR2作用，可激活細胞釋放IFN－α、IL－6、IL－10與IL－12等促炎因子，并且脂蛋白 Omp19可下調IFN－γ的釋放，進而抑制人類單核細胞的抗原提呈功能［11］。

2．2 布魯氏菌侵染胎盤滋養層細胞作用機制 胎盤滋養層細胞可通過其表面熱休克蛋白70與Bru結合，從而啟動內吞途徑，而且胎盤滋養層細胞表面IFN－γ受體的表達，也可促進其對Bru的吞噬。懷孕晚期Bru在胎盤滋養層細胞中生長繁殖，細菌大量快速的復制可以破壞胎盤的完整性或感染胎兒，最終導致流產或產下弱仔、帶菌胎兒。目前對感染了Bru的胎盤滋養層細胞中的環境變化知之甚少，反芻動物胎盤滋養層細胞感染Bru后可產生大量的赤藻糖醇，此物質可刺激細菌在細胞中的生長繁殖。

2．3 樹突狀細胞與布魯氏菌相互作用機制 DCs是目前所知道的功能最強、能激活初始性T細胞的專職APCs。它不僅可以通過MHCⅠ、MHCⅡ 類途徑提呈抗原，而且還擁有提呈脂類抗原的CD1分子。DCs攝取抗原主要有兩條途徑，一為巨吞飲作用，即細胞骨架依賴型的、由膜皺折和囊泡形成的液相內吞作用；第二條是由甘露糖受體、TLR等受體介導的內吞途徑。

DCs主要表達 TLR2、TLR3和 TLR4，其中TLR2與TLR4已被證明主要識別菌類抗原。研究表明，APCs對G＋／G－菌、結核分枝桿菌、螺旋菌與支原體表面的脂磷壁酸、肽聚糖與LPS等抗原的識別需要TLR2進行信號傳導［12］，而 TLR4不能識別革蘭氏陽性菌及其抗原，但已被公認為是LPS的主要信號傳導受體。被CD14與TLR轉染后的CHO細胞系可經TLR2與TLR4識別Brucella abortus，但LPS與類脂質A只能通過TLR4識別，且從光滑型Bru分離的類脂質A更能引起DCs的成熟［13］。對熱殺死的Brucella abortus，TLR2可促進機體分泌TNF，但不依賴于TLR4。體內外實驗表明，Bru Btp1蛋白與DCs TLR2受體作用，可抑制 DCs的成熟［14］。Sebgupta Dola發現 Bruspp．基因組編碼的TcpB蛋白與Toll／IL－1有很高的同源性，它的表達可致磷酸纖維素的降解，阻止MyD88－adapter－like（MAL）信號的形成，有助于Bru逃避天然免疫系統的識別［15］。另有研究表明，Bru通過結合一個長鏈脂肪酸渣C28而改變LPS的結構，從而逃避與宿主細胞TLR4受體結合。由于Bru鞭毛素蛋白某個區域缺失，因此與TLR5結合的能力較弱。DCs與巨噬細胞膜表面含有大量的甘露糖受體，據研究，位于結核分枝桿菌細胞壁上的 ManLAM（mannose－capped lipoarabinomannan）結合到甘露糖受體上，可限制吞噬小體與溶酶體融合，從而得以在巨噬細胞中生存，造成持續感染［16］。兔熱桿菌在血漿調理素缺乏的情況下，可競爭性的抑制甘露糖受體與甘露聚糖的活化，從而降低肺膠原凝集素表面活化劑蛋白A的調理作用，構成有利于兔熱桿菌生存的胞內微環境［17］。研究表明，高濃度甘露糖結合凝集素可競爭性的結合于單核DCs，從而抑制Bru LPS誘導單核DCs的成熟與TNF－α等細胞因子的釋放［18］。雖然 VirB操縱子在Bru感染巨噬細胞過程中發揮著重要作用，但是對DCs的成熟與DCs誘導的Th1細胞免疫應答沒有作用。Bru侵入DCs后，可依賴其外膜蛋白Omp25抑制TNF－α的分泌，從而進一步抑制感染了Bru的DCs的成熟與提呈抗原給初始性T細胞的功能，并且可抑制IL－12的分泌［19－20］。另有研究證明，Bru脂蛋白Omp19能夠促進DCs的成熟與T細胞向Th1免疫應答的發展［21］。因此，在Bru感染過程中，DCs的活化在刺激與調節T細胞分泌IFN－γ方面發揮了重要作用。

2．4 巨噬細胞、樹突狀細胞與布魯氏菌相互作用機制 巨噬細胞是Bru的主要靶細胞，Bru侵入巨噬細胞后可通過抑制TNF－α的分泌而抑制巨噬細胞凋亡，從而可在細胞內生存并大量繁殖，削弱巨噬細胞吞噬功能，使巨噬細胞的殺傷作用與抗原提呈功能部分喪失，最終逃避宿主的免疫監視；另一方面，巨噬細胞激活初始T細胞的能力較弱，也不表達有抗原提呈功能的CD1分子，故不能有效提呈脂類抗原給NKT細胞；這可能是導致Bru持續感染形成的原因。而DCs是目前所知功能最強大、且能激活初始性T（na?ve T cell）細胞的專職抗原提呈細胞。DCs的抗原提呈是一個動態過程［22］。非淋巴樣組織內定居的未成熟DCs，具有強大的抗原攝取功能，是機體進行免疫防御的前哨細胞。因此在Bru感染過程中，巨噬細胞與DCs的相互作用機制成為了近期研究的熱點。

DCs是連接天然免疫應答與適應性免疫應答的橋梁，研究表明，熱殺死的Brucella abortus作用于DCs與巨噬細胞TLR9受體，一方面刺激DCs分泌IL－12p40，誘導IFN－α與IFN－γ等細胞因子的釋放，從而促進Th1細胞免疫應答。另一方面，Bru活化的巨噬細胞可提高 NK細胞的殺菌活性［23］。脂蛋白Omp16與巨噬細胞／DCs TLR4受體結合，從而刺激機體產生抗Bru特異性Th1樣細胞免疫應答，而且該蛋白被證明是第一個不需要佐劑便可啟動抗Bru免疫應答的蛋白［24］。外膜蛋白Omp25可刺激巨噬細胞與DCs釋放等量的TNF－α。機體感染Bru后，MyD88對于DCs的成熟及TNF－α、IL－12的分泌有重要作用，而且IL－12的產生依賴于TLR2受體，但是對于巨噬細胞，IL－12的分泌卻與TLR2、TLR4受體無關，TLR9基因敲除小鼠感染Bru后，體內含菌量明顯高于正常小鼠，證明TLR9對于清除Bru有重要作用［25］。據報道，在體外培養體系中，DCs對 Brucella suis、Brucella abortus與Brucella melitensis表現出更大的易感性［19］，但我們的研究發現，巨噬細胞對Brucella suis的吞噬能力要明顯強于DCs，巨噬細胞體外負載Bru12h后出現類似于壞死性凋亡的現象，而DCs卻始終保持形態結構的完整。Cristel Archambaud等研究發現，鼻內接種Brucella abortus后，Brucella abortus優先感染肺泡巨噬細胞，肺泡巨噬細胞的清除促進了DCs向引流淋巴結的遷移［26］。然而與肺臟接種Bru結果不同的是，本課題組在證明陰道DCs具有提呈Bru抗原能力的基礎上，發現陰道巨噬細胞的清除，不僅沒有使DCs表現更多的遷移，相反，卻出現了DCs不向引流淋巴結遷移的現象，表明在Bru感染過程中，DCs捕獲Bru并向淋巴結遷移的過程具有巨噬細胞依賴性，同時巨噬細胞的清除降低了機體抗Bru的Th1型細胞免疫應答水平［27］。

3 小 結

Bru含有不同的毒力因子，可降低抗原提呈細胞的吞噬能力與抗原提呈能力，延緩細胞成熟，抑制細胞凋亡，減少相關細胞因子的釋放。Bru通過改造細胞內環境，從而得以在抗原提呈細胞（巨噬細胞與DCs）中生長繁殖。機體對抗Bru主要以細胞免疫應答為主，主要包括巨噬細胞、DCs等抗原提呈細胞及CD4＋與CD8＋T細胞的活化，其他細胞如NK細胞、Vγ9Vδ2T細胞等也可促進細胞免疫應答。Bru感染初期主要以Th1細胞免疫應答為主，該反應對于清除Bru是至關重要的，但Bru可通過擾亂天然免疫系統的作用從而不同程度的破壞Th1細胞免疫應答及T細胞的作用。Bru誘導的Th1免疫應答可引起IFN－γ與IL－2等因子的釋放，IFN－γ可激活巨噬細胞強大的殺菌作用，刺激CD8＋T細胞產生細胞毒作用以及誘導感染了Bru的巨噬細胞凋亡，而且IFN－γ與IL－2促進了巨噬細胞與DCs的抗原提呈及共刺激分子的表達。作為Bru的宿主細胞，DCs與巨噬細胞在抗原提呈及誘導機體免疫應答方面具有重要作用，但是由于不同種Bru的免疫原性的不同，其與相關宿主的關系及誘導的機體的免疫應答還有待進一步研究。

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