端粒、端粒酶、shelterin與獲得性再生障礙性貧血的研究概況①

王 琰 徐瑞榮 (山東中醫藥大學附屬醫院血液病科，濟南250011)

再生障礙性貧血(Aplastic anemia，AA，簡稱再障)是由多種原因引起的造血干細胞數量下降和功能異常，導致全血細胞減少的一種綜合病癥，是骨髓衰竭綜合征的一種。AA可以分為獲得性和遺傳性的，獲得性AA又分為原發性AA和繼發性AA兩類。近年來，端粒和端粒酶成為生命科學研究的熱點之一，在獲得性AA中發現，部分患者與同年齡組的正常人相比端粒縮短。對骨髓衰竭綜合征包括獲得性AA患者來說，具有潛在的白血病轉化傾向和高的實體瘤發生率，提示端粒和端粒酶的異常對再障的發生、發展、治療及轉化都有一定的影響，現就再障與端粒、端粒酶及保護端粒的蛋白復合體Shelterin的相關研究作一綜述。

1 端粒與再障

1.1端粒 端粒是真核細胞內線性染色體末端的一種特殊“帽狀”結構，由端粒DNA和端粒蛋白組成。其生物學功能是防止染色體末端的降解、丟失及端-端不規則融合，對維持染色體的完整性和穩定性有重要作用。人類在出生的時候端粒約有10～15 kb，隨著細胞的分裂次數增加，端粒的長度不斷地縮短，在人有核血細胞，平均端粒長度隨年齡增大而顯著減小，特別是免疫系統的細胞。當端粒縮短達到一個臨界長度(2～4 kb)時，就會認為是雙鏈斷裂DNA損害，喪失保護染色體末端的功能，導致不可逆地退出細胞周期，從而走向衰亡［1］。

1.2端粒長度與再障的發病 近年來的研究發現，大約1/3的獲得性再障患者有白細胞端粒縮短，用流式-熒光原位雜交方法、Southern blot方法、定量聚合酶鏈反應(PCR)法等檢測都得出了相似的結果［2-4］，再障患者粒細胞端粒長度較同年齡段正常組明顯縮短，外周血單個核細胞的端粒長度平均比年齡匹配的正常對照組短1.41 kb(P＜0.001)。端粒的縮短與外周血中性粒細胞減少的程度和治療后血象的提升有正相關，與疾病發現的早晚并無相關性，提示再障在發病時就失去了部分端粒長度，再障端粒的縮短可能反映了造血干細胞造血功能的缺陷。

端粒侵蝕也可能為我們提供有關疾病階段的信息。在持續性血細胞減少的獲得性再障患者，端粒損失和病程之間存在顯著相關(P＜0.0001)［5］，除了正常的年齡有關的損失，相當于端粒逐漸侵蝕216 bp/年。研究發現，中間型再障患者有顯著的端粒縮短(P=0.01)，對這組的病程分析顯示，這組患者有很長的血細胞減少史［2］。重型再障和外周血單核細胞的個人年度端粒縮短的速率(IATSR)顯著相關(P＜0.001)，自發性細胞凋亡在重型再障患者或高的IATSR患者中最高(大于200 bp/年)(P＜0.01，n=18)［6］。

1.3端粒長度與再障的演變及治療 對獲得性再障患者來說，白細胞端粒長度是惡性克隆發展的重要預測指標，且與再障的復發及死亡率有關，并與血液復發概率成反比。端粒越短，發生克隆演變的可能性就越高［4］。成人端粒較短的再障患者轉化為骨髓增生異常和白血病的可能性最高［7］。有研究發現，在5例端粒長度小于5 kb的再障患者中，2例進展期的獲得性再障患者有細胞遺傳學異常，反映了骨髓已經出現深度發育不良，提示端粒侵蝕可能與再障演變為骨髓增生異常綜合征的發病機制相關［5］。

同時，在研究中也發現，基于再障發病的免疫基礎，高達75%的再障患者對免疫抑制治療(IST)有反應［8］。那些對免疫抑制治療反應良好和服用免疫抑制劑恢復的患者，端粒平均長度與同年齡段的正常對照組并無明顯差異，而一些對免疫抑制劑反應差或未進行治療的三系嚴重減少的患者端粒長度明顯縮短，并與正常組差異明顯。而對于接受免疫抑制治療的重型再障患者來說，端粒長度與治療效果無關，但與復發的風險，克隆演化，整體存活率有關［4］。這提示我們在臨床治療再障過程中，通過檢測端粒的長度，可以更好地有針對性地治療再障，并對再障的預后有初步的評斷。

2 端粒酶與再障

2.1端粒酶 端粒酶是由RNA和蛋白質組成的一種核糖核蛋白。是一個特殊的反轉錄酶，活化后以自身RNA為模板，端粒3＇末端富G單鏈為引物合成端粒中重復DNA序列加到端粒末端而維持端粒長度，以防止端粒隨細胞分裂而不斷損耗，從而保護染色體。哺乳動物的端粒酶復合物主要有反轉錄酶(Telomerase reverse transcriptase，TERT)和 RNA 模板(Telomerase RNA component，TERC)組成。此外，另外四個蛋白 GAR1、NHP2、NOP10和 dyskerin組成核仁核糖蛋白復合物結合端粒酶，這些蛋白的缺失會導致端粒酶失活。

除在生殖細胞、成體干細胞、胚胎干細胞和活化的免疫細胞外，端粒酶在正常體細胞中無活性或檢測不出其活性。當端粒長度足夠長時，端粒酶活性對細胞分裂不是必需的，只有當端粒的長度縮短到特定范圍時，端粒酶活性的有無才成為關鍵因素。端粒酶活性主要由TERT表達水平的高低決定。TERT的突變會導致端粒酶活性的改變。

2.2端粒酶基因突變與再障的發病機制 在獲得性再障患者中發現復雜的端粒酶基因的遺傳突變對再障的臨床管理有重要意義。端粒酶基因的突變可導致再障患者端粒酶活性降低，端粒縮短加速，減少造血祖細胞增殖能力。在1/3有端粒縮短的獲得性再障患者中有一部分伴有端粒酶的突變(TERC基因或 TERT基因)，約占所有獲得性再障患者的4% ～10%，但沒有發現 DKC1、NOP10和 NHP2的突變，雖然在這些基因分析中發現非同義單核苷酸多態性，但與對照組有類似的總體等位基因頻率［9-11］。

研究發現，遺傳性TERC突變導致的端粒酶活性和端粒維持損失，可能會限制骨髓干細胞再生［12］。在再障患者中，有一些TERC突變與端粒維持通路的遺傳病變有關，有一些突變能破壞TERC的二級結構或折疊［13］。經過一項正常和突變TERC分子的端粒酶重組實驗表明，TERC的突變是由于單倍劑量不足引起的。在無負性干擾的情況下，TERC的變異使端粒酶活性降低或取消，導致端粒合成功能的喪失［14］。在中國北方再障患者的血液樣本中也檢測出了 TERC突變，發生率與西方相似［15］。

有報道，TERT基因的突變是通過單倍劑量不足機制破壞了端粒酶活性，從而造成了白細胞端粒縮短和造血干細胞室的增殖能力有限［9，10］。有TERT突變的患者外周血白細胞端粒明顯縮短，且發現有突變患者的親屬也具有造血障礙，其CD34細胞數的減少、造血集落形成減少、造血生長因子水平增加以及短端粒［16］，揭示了基因突變的家族傾向。體外培養突變的患者及親屬的外周血白細胞發現，培養細胞的端粒酶活性較正常對照組減少了約50%，說明TERT突變相關再障降低端粒酶活性的機制是單倍劑量不足：即其余的正常等位基因不足以生產足夠數量的酶。另有不同的研究發現，在慢性再障患者中骨髓單個核細胞的端粒酶活性是增高的。Shen等［17］在22例兒童再障患者中測定了骨髓單個核細胞的端粒酶活性，高于正常對照組的兩倍，分析端粒酶活性增加與再障患者潛在的造血負反饋有關。兩種不同的研究結果說明關于端粒酶的活性在獲得性再障的研究中還存在爭議，有待于大量的實驗數據的進一步驗證。

TERT和TERC的突變可以被視為人類基因造血衰竭的危險因素。端粒長度維持缺陷導致造血干細胞室減少，可能會特別容易受到環境傷害。

2.3端粒酶基因突變與再障的治療選擇 對獲得性再障患者來說，抗胸腺細胞球蛋白加環孢素的免疫抑制劑和造血干細胞移植是主要治療方法。Yamaguchi等［9］在再障患者的臨床治療中發現，200例獲得性再障患者中7例有TERT突變的患者，沒有一例對免疫抑制治療有反應，表明一個或多個特定基因的突變可能會影響治療的選擇——選擇具體的藥物治療方案或決定接受干細胞移植。對于要接受干細胞移植的患者，合適的供者選擇很重要，再障患者基因突變的檢測為端粒酶缺陷的病人移植選擇合適的造血干細胞家屬捐贈者提供了依據［18］。基于這個原因，測量血液中白細胞端粒長度和進行端粒酶基因突變的檢測在獲得性再生障礙性貧血的管理中很重要。

此外，端粒酶活性的調節可能在有端粒缺陷的綜合征的治療中發揮作用，如端粒酶突變的獲得性再障。端粒酶活性可被性激素調控。臨床觀察發現，雄激素治療可誘導改善外周血計數，60%的患者能夠達到不依賴輸血［19］。機制可能是雄激素能刺激造血細胞中端粒酶基因表達，包括CD34+細胞和淋巴細胞［20］。此類研究對于當前雄激素化合物的選擇和臨床使用的未來發展有潛在影響［21］。但需要注意的是，雄激素治療可能引起嚴重不良反應，如肝癌、肝紫斑病等，必須監測肝功能。

3 Shelterin與再障

3.1Shelterin 哺乳動物細胞中端粒的結合蛋白是由六個蛋白組成的端粒特異性蛋白復合體，這個復合體被稱之為Shelterin，包括端粒重復序列結合蛋白 1(Telomere repeat binding factor1，TRF1)、端粒重復序列結合蛋白2(Telomere repeat binding factor1，TRF2)、Rap 1(Repressor activator protein 1)、TIN 2(TRF1-interacting nuclear protein 2)、TPP1(以往被分別稱為TINT1或PTOP或PIP1)和端粒保護蛋白1(protection of telomeres 1，POT1)六個蛋白。這些Shelterin組分特異性地結合在端粒上，并且在細胞周期的各個階段都有表達。TRF1和TRF2與端粒雙鏈DNA直接結合，Rap1通過和TRF2相互作用而結合在端粒上;TIN2則在很大程度上發揮了一種橋連作用，同時和TRF1、TRF2以及TPP1相互作用;POT1直接與端粒的單鏈DNA結合;TPP1同時與TIN2以及POT1相互作用連接起Shelterin在單鏈DNA和雙鏈DNA結合的蛋白復合物，從而形成一個龐大的六元復合體結合端粒末端。

Shelterin的兩個主要功能是端粒酶的募集，調節和保護染色體末端。染色體末端缺乏端粒保護將激活DNA損傷反應，而Shelterin的存在使得細胞得以區分端粒末端和普通的DNA雙鏈斷裂(DNA double strand break，DSB)，從而抑制DNA損傷修復蛋白，避免染色體末端異常融合，同時調控端粒的端粒酶延伸途徑。因此，Shelterin的穩定對于端粒的維持有著至關重要的作用。隨著端粒序列的延伸，結合在端粒末端的Shelterin會越來越多，因此也存在counting機制來維持端粒的長度。研究顯示，Shelterin的組分出了具有特定的功能外，對于端粒的長度都有負調控作用。

3.2Shelterin與再障的發病及治療 1/3的再障患者有短端粒，但突變只有不到10%，對這一現象最有趣的解釋是因為有其他基因的參與，包括大型復雜修復的其他成員、Shelterin、仍然模糊的替代修復系統的組成部分和一些DNA解旋酶［22］。

研究發現，Shelterin組件(TERF1和TERF2)特定的基因單體型編碼，可能有助于疾病發病，TRF1和TRF2是直接綁定到端粒DNA鏈，在調節端粒長度的同時保護端粒不被損壞，突變減少了它們的表達或者減少了它們綁定到DNA的數量導致了端粒侵蝕。也可能因為突變導致造血干細胞室的數量減少，使其可能在數量上不足以維持免疫介導的損傷。Savage等［23］通過對獲得性再障患者和健康對照的TERF1和TERF2基因單核苷酸多態性(SNP)對比分析認為，TERF1的遺傳變異可能與AA風險增加有關，但仍需要更多的研究證實;TERF2的變異與再生障礙性貧血沒有顯著相關。

有報道在1～5%的獲得性再障患者中檢測出了TINF2的雜合子突變，但TINF2的突變在非先天性角化不良患者中不起主要作用［24］。Yamaguchi等［25］在排除了攜帶端粒酶基因突變基因TERC or TERT的2例(1.4%)日本獲得性重型再障患者中發現有TINF2雜合突變，且與正常相配年齡的健康人比較，有更短的端粒長度。對免疫抑制治療無反應。用美替諾龍治療，沒有顯示出任何良好的臨床反應，這與用雄激素治療TERT突變的骨髓衰竭綜合征有良好的血液學反應不同。

4 展望

近幾年來，再障與端粒、端粒酶及其相關蛋白之間的關系研究日益受到血液學研究者的重視。目前的研究基本都集中在測定外周血及骨髓端粒長度、端粒酶活性及端粒相關蛋白基因突變等方面，研究者們試圖從中找出規律，為再障患者的發病、疾病進展及轉化提供有益的指導，尤其是對臨床應用價值更大的端粒酶突變的研究，如果發現出現突變，可作為免疫抑制劑治療無效的一個指標，為臨床針對性更強用藥提供依據。另外，對出現端粒酶突變的患者來說，如果選擇造血干細胞移植治療，其同胞供者的端粒酶突變檢測也很重要，不排除患者的同胞健康供者之一亦會有端粒酶突變。這種情況下，則強烈提示我們此再障患者的發病有家族、遺傳、先天性因素參與。此時，應高度懷疑先天性骨髓造血衰竭，并做相應的檢查及鑒別診斷，此種情況下，同胞供者的骨髓移植并非最佳首選，應考慮無關供者的骨髓移植。端粒及端粒酶的深入研究將為再障患者尋找最適治療方案提供幫助，以期達到提高再障患者的生存率及治愈率的目的。

端粒、端粒酶、Shelterin之間相互作用，是密切相關的。目前的研究結果揭示了一部分獲得性再障患者存在外周血白細胞端粒縮短、端粒酶基因和部分端粒保護蛋白突變、外周血端粒酶活性降低而骨髓端粒酶活性升高的現象，這部分患者可能有遺傳背景，在治療的選擇上也更為慎重。但對再障患者端粒相關的基因蛋白的表達水平及相互作用關系，及可能參與的疾病發生發展信號通路等少有具體研究和報道。鑒于目前Shelterin研究的內容尚不全面，已知的六種蛋白它們之間的相互作用及其相互關聯與再障發生發展的關系目前尚不清楚，這將是今后需要研究的重點。目前，關于再障患者遺傳方面的研究包括染色體核型改變、基因突變等都有一定進展，但是關于染色體末端的構成部分——端粒、端粒酶以及端粒保護蛋白的研究遠不完善，這為今后的研究提供了很大的空間。進一步研究它們及其之間的關系有望為獲得性再障患者的臨床管理提供更準確的依據。

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