丹酚酸B對大鼠腎缺血再灌注損傷的保護作用

唐桂毅，李靖菲，李琳，徐成*，邵力鈞，周曉棉

(1.沈陽藥科大學，遼寧沈陽110016;2.呼倫貝爾市人民醫院藥劑科，內蒙古呼倫貝爾021008)

缺血再灌注損傷(Ischemia-reperfusion injury，IRI)是指缺血組織或器官重獲血流灌注或氧供應后，對組織或者器官所產生的損傷作用。腎臟為高灌注器官，對缺血及缺血后再灌注均較敏感［1］，因此腎缺血-再灌注損傷(Renal ischemia-reperfusion injury，RIRI)在臨床上較為常見，其病理生理變化多見于急性失血、中毒性休克、腎血管手術和腎臟移植等過程中。

丹酚酸(salvianolic acid)系丹參的水溶性有效成分，屬酚酸類化合物，在丹參的功效作用中占有重要地位。丹酚酸的基本化學結構為丹參素。丹酚酸B由三分子丹參素與一分子咖啡酸縮合而成，是目前研究較多的丹酚酸之一［2］。丹酚酸B具有廣泛的藥理作用，已有研究表明丹酚酸B對腦損傷、心肌缺血再灌注以及肝纖維化等方面有較好的保護作用［3］，但對RIRI的保護作用少見文獻報道。本實驗研究了丹酚酸B對RIRI大鼠的保護作用，并初步探討其作用機制。

1 材料

1.1 藥物與試劑丹酚酸B(純度為95%，沈陽藥科大學天然藥化教研室提供);水合氯醛(天津瑞金特化學品有限公司，批號20071016);超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase，SOD)、丙二醛(Malondialdehyde，MDA)、白介素-6(Interleukin-6，IL-6)、白介素-8(Interleukin-6，IL-8)、腫瘤壞死因子-α(Tumor Necrosis Factor-α，TNF-α)、尿蛋白(Proteinuria，PU)定量測試盒(南京建成生物工程研究所，批號20080407)，血清肌肝(Creatinine，Cre)、尿素氮(Urea nitrogen，BUN)試劑盒(北京北化康泰臨床試劑有限公司，批號20071029)。

1.2 實驗動物Wistar雄性大鼠，50只，體質量(250±20)g，由沈陽藥科大學實驗動物中心提供，合格證號:SCXK(遼)2003-008。

1.3 實驗儀器721型分光光度計(上海精密科學儀器有限公司)，二氧化碳培養箱(美國Hu Air)，Model450自動酶標檢測儀(Bio-Rod)。

2 實驗方法

2.1 實驗分組及給藥將50只雄性Wistar大鼠按體質量隨機分成5組，每組10只:缺血再灌注組(模型組)、假手術組(對照組)及丹酚酸B治療組(丹酚酸B 2.5、5.0、10.0 mg/kg組)。丹酚酸B各治療組分別于術前24 h和術后24 h、48 h腹腔注射同質量分數的丹酚酸B各1次，給藥容積為10 mL/kg(模型組和假手術組給予同容積的0.9%氯化鈉注射液)。

2.2 動物模型制作大鼠術前禁食不禁水12 h，3.5%水合氯醛10 mL/kg腹腔注射麻醉，腹部備皮，碘伏消毒后，腹部正中切口暴露雙側腎臟，鈍性分離雙側腎動脈，保護輸尿管，距腎門0.5 cm處用無創動脈夾夾閉雙側腎動脈，夾閉50 min后松開動脈夾恢復灌注，腎臟由暗紅色恢復紅潤表明再灌注成功;如果松開動脈夾5 min未恢復紅潤，則視為再灌注失敗，棄去不用。然后逐層縫合切口。假手術組只暴露雙側腎蒂(不結扎)，暴露50 min后再關閉切口，不做腎缺血處理。

2.3 檢測指標采集的大鼠血液3 000 r/min離心15 min后取血清分裝后－80℃冰箱保存，按檢測試劑盒說明書方法分別測定Cre、BUN、MDA、SOD、IL-6、IL-8和TNF-α的水平。術后48～72 h內收集大鼠尿液，用來檢測尿中含尿蛋白量。術后72 h處死大鼠，取兩側腎臟置于10%中性甲醛固定以制備石蠟切片，于光鏡下觀察腎組織形態學變化。

3 實驗結果

3.1 血清中BUN、Cre和尿液中尿蛋白的變化情況模型組與假手術組比較，前者大鼠血清中BUN、Cre和尿液中尿蛋白水平明顯升高;與模型組比較，治療組能夠劑量依賴性的降低RIRI后血清中BUN、Cre和尿液中尿蛋白水平，其中以丹酚酸B高劑量組(10.0 g/kg)尤為明顯。結果見表1。

表1 對RIRI大鼠BUN、Cre和PU的影響(±s，n=10)Tab.1 Effects of salvinolic acid B on contents of BUN，Cre and PU in RIRI rats(±s，n=10)

表1 對RIRI大鼠BUN、Cre和PU的影響(±s，n=10)Tab.1 Effects of salvinolic acid B on contents of BUN，Cre and PU in RIRI rats(±s，n=10)

注:與模型組比較，*P＜0.05，＊＊P＜0.01。

組別劑量/(mg·kg－1)BUN/(mmol·L－1)Cre/(μmol·L－1)PU/(mg·L－1)28.11±3.96174.69±12.99167.01±8.61假手術組－7.11±2.02＊＊88.87±9.06＊＊6.26±4.23＊＊丹酚酸B組2.524.58±1.92157.54±10.24156.61±9.18丹酚酸B組5.021.22±3.50130.18±9.80*117.05±7.62*丹酚酸B組10.017.10±2.31*111.86±11.04＊＊86.81±8.93模型組－＊＊

3.2 對腎組織病理學的改變腎組織以10%中性甲醛溶液固定，在脫水、透明、浸蠟、包埋后，切成石蠟切片，經HE染色，400倍光鏡下觀察腎組織損傷情況。光鏡下，假手術組腎組織結構未見異常;丹酚酸B 10 mg/kg組腎小球、腎小管結構基本完整，腎間質未見異常;模型組腎小管上皮細胞變性、壞死，少數腎小管腔內有少量蛋白質液積聚，腎小球出現水腫、萎縮。結果見圖1。

圖1 腎組織在光鏡下形態Fig.1 Morphous of kidney under light microscope

3.3 血清中SOD、MDA的變化情況與假手術組比較，模型組大鼠血清中MDA水平明顯升高，SOD活性明顯下降;與模型組比較，治療組能夠劑量依賴性降低RIRI后血清中MDA水平，升高SOD活性，其中以丹酚酸B高劑量組(10.0 g/kg)作用最顯著。結果見表2。

表2 對RIRI大鼠血清中SOD和MDA的影響(±s，n=10)Tab.2 Effects of salvianolic acid B on contents of SOD and MDA in serum in RIRI rats(±s，n=10)

表2 對RIRI大鼠血清中SOD和MDA的影響(±s，n=10)Tab.2 Effects of salvianolic acid B on contents of SOD and MDA in serum in RIRI rats(±s，n=10)

注:與模型組比較，*P＜0.05，＊＊P＜0.01。

組別劑量/(mg·kg－1)SOD/(U·mL－1)MDA/(nmol·mL－1)86.03±6.6313.76±1.39假手術組－159.72±5.02＊＊6.43±1.09＊＊丹酚酸B組2.599.34±7.1412.19±1.45丹酚酸B組5.0116.52±6.56*10.08±1.02*丹酚酸B組10.0135.95±5.21＊＊8.15±1.27模型組－＊＊

3.4 血清中IL-6、IL-8、TNF-α的變化情況模型組與假手術組比較，前者大鼠血清中IL-6、IL-8、TNF-α水平顯著升高;與模型組比較，治療組能夠劑量依賴性降低RIRI后血清中IL-6、IL-8、TNF-α水平，其中以丹酚酸B高劑量組(10.0 g/kg)作用更明顯。結果見表3。

表3 對RIRI大鼠血清中IL-6、IL-8和TNF-α的影響±s，n=10)Tab.3 Effects of salvianolic acid B on contents of IL-6，IL-8 and TNF-α in serum in RIRI rats±s，n=10)

表3 對RIRI大鼠血清中IL-6、IL-8和TNF-α的影響±s，n=10)Tab.3 Effects of salvianolic acid B on contents of IL-6，IL-8 and TNF-α in serum in RIRI rats±s，n=10)

注:與模型組比較，*P＜0.05，＊＊P＜0.01。

組別劑量/(mg·kg－1)IL-6/(pg·mL－1)IL-8/(pg·mL－1)TNF-α/(pg·mL－1)54.64±5.9227.58±2.6085.16±3.63假手術組－15.02±3.66＊＊17.91±1.54＊＊54.12±2.18＊＊丹酚酸B組2.549.96±5.1025.35±2.1881.51±3.77丹酚酸B組5.037.30±5.61*23.31±2.4870.38±2.59*丹酚酸B組10.026.05±4.64＊＊20.37±1.92*61.42±3.67模型組－＊＊

4 討論

腎缺血再灌注能夠造成腎單位的廣泛性破壞，包括腎小球濾過率下降，但其通透性增強;腎小管上皮細胞受損，導致腎小管的重吸收作用減弱等。常見臨床表現為血清中BUN和Cre升高，同時出現蛋白尿［4-5］等癥狀。本實驗結果顯示，丹酚酸B能顯著降低血清中BUN、Cre和尿液中尿蛋白的含量，減輕缺血再灌注對腎小球和腎小管的損傷。因此，丹酚酸B對RIRI大鼠有較好的保護作用。

雖然RIRI的發病機制尚未完全清楚。但近年來的研究表明大量氧自由基的產生以及免疫細胞介導的炎癥反應在RIRI的發病中起關鍵作用［6-7］，并且存在一定的聯系。

RIRI時，大量的氧自由基(Oxygen free radicals，OFR)可通過黃嘌呤氧化酶、線粒體和花生四烯酸等多種途徑，由組織血管內皮細胞和中性粒細胞產生。近年大量研究證實，自由基反應是導致腎缺血再灌注損傷的重要原因［8］，其損傷機制為:①OFR可直接與生物膜上的不飽和脂肪酸(PUFA)發生脂質過氧化反應，其產物MDA對細胞產生毒性作用;②OFR可破壞蛋白質、核酸以及細胞間基質，從而加劇細胞損傷;③腎臟缺血時，增加的OFR可誘發組織細胞凋亡，進一步加重腎臟損傷;④RIRI時，可促進某些促炎基因產物的表達和生物活性分子的產生，促進白細胞激活和趨化聚集，引起炎癥級聯反應，加重腎損傷。SOD是超氧陰離子的專一性活化酶，其活性的高低反映了機體抗自由基水平的強弱［9］。由于氧自由基半衰期太短很難直接測定，所以常選擇測定SOD的活力;而MDA是脂質過氧化的最終產物，它的含量反映了自由基攻擊機體細胞的損傷程度。本實驗結果顯示，丹酚酸B能夠升高RIRI大鼠血清SOD的活性，降低MDA的水平。因此，丹酚酸B對RIRI的保護作用可能是通過抑制脂質過氧化物的形成、提高機體SOD的活性并提高清除自由基能力，從而打破氧自由基介導的細胞損害作用，保護細胞膜結構和功能的完整性來實現的。

文獻證明許多炎癥因子參與了RIRI的病理生理過程［10］，其中TNF-α、IL-6和IL-8是介導炎癥反應的重要細胞因子。而TNF-α具有廣泛的生物學作用，被認為是重要的促炎因子［11］。在RIRI期間，TNF-α參與RIRI的可能機制［12］是:①TNF-α誘導單核巨噬細胞、中性粒細胞等分泌和釋放IL-6、IL-8、OFR和TNF-α本身等炎癥介質，啟動瀑布式炎癥級聯反應，使炎癥反應放大［13-14］;②炎癥時，炎癥介質誘導細胞產生iNOS，并合成大量NO，高濃度的NO具有潛在的有害作用，一方面引起持續的血管擴張，使血壓下降，導致腎臟進一步缺血，炎癥損傷加重;另一方面，NO可產生細胞毒性物質，如過氧亞硝酸鹽及其不穩定過程中分解的羥自由基，進而引起腎臟損傷;③TNF-α可上調血管內皮細胞表達黏附分子，增加中性粒細胞、嗜酸性粒細胞與血管內皮細胞黏連，有助于白細胞炎癥滲出及其它炎癥細胞遷移至炎癥區;同時這種黏連能堵塞微循環，最終導致再灌注后無復流現象［15］;④IL-8激活中性粒細胞，促進中性粒細胞介導的呼吸爆發，引起酶的外釋和OFR的增加，加強致炎反應，對腎臟造成損傷。本實驗結果顯示，丹酚酸B組能夠降低RIRI后血清中IL-6、IL-8、TNF-α水平，從而減輕腎I/R損傷程度。因此，丹酚酸B抗大鼠RIRI的機制可能與抑制炎癥反應有關。

Bonventre等［16］以及Chien等［17］證明在RIRI中，OFR的產生與早期凋亡及炎癥反應相關聯，說明OFR參與了炎癥反應。發生炎癥反應時，炎癥細胞可以釋放大量細胞因子如TNF-α、IL-6、IL-8等，使白細胞呼吸爆發，又產生大量的OFR，結果造成嚴重的氧化應激，導致一種惡性循環。因此，丹酚酸B的作用機制可能是:①通過減少腎缺血再灌注損傷后自由基的產生，從而間接的減輕腎缺血再灌注損傷后的炎癥反應;②直接降低OFR對中性粒細胞、內皮細胞、巨噬細胞內核蛋白因子(nuclear factor kappa，NF-κB)的活化作用，來減少炎性因子基因的轉錄和表達，緩解了炎癥反應。

綜上所述，丹酚酸B對RIRI大鼠具有較好的保護作用，其作用機制可能是通過減輕RIRI后氧自由基的損傷以及緩解炎癥反應來實現的。

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