牙髓干細胞在再生醫(yī)學中的研究進展

鄭 偉 劉朋飛 馮業(yè)童 董 超 周余來 (通化市口腔醫(yī)院，吉林 通化 34000)

干細胞是一類具有自我復制能力和一定分化潛能的細胞，在一定條件下，它可以分化成多種具有不同功能的細胞。根據(jù)干細胞所處的發(fā)育階段及其功能學特性，可將其進一步分為胚胎干細胞和成體干細胞。因此，干細胞在組織工程、再生醫(yī)學中有著重要的應用價值。目前，牙齒缺損等牙源性疾病在中老年人中發(fā)病率較高。牙髓干細胞(dental pulp stem cell，DPSC)是牙髓組織中的一類成體干細胞，具有一定的分化潛能和增殖能力，在牙齒再生、牙髓修復方面有著重要的應用價值，特別是隨著相關組織工程技術的發(fā)展，DPSC具備了成為一種新型種子細胞的潛能〔1〕。

1 DPSC的定義和基本生物學性質(zhì)

成牙本質(zhì)細胞是一種終末細胞，不具備進一步分化的能力，因此，一般認為成牙本質(zhì)細胞在遭受損傷后，牙髓內(nèi)的某些具有分化功能的前體細胞可進一步分化為成牙本質(zhì)細胞，并分泌相關細胞基質(zhì)，修復受損組織，這種前體細胞即為DPSC。DPSC具有較強的增殖能力和較高的分化潛能，正是這兩種生物學性質(zhì)，決定了DPSC在牙源組織修復和骨性修復方面具有重要的作用〔2〕。

Gronthos等〔3〕在2000年首次正式提出了DPSC的概念，把牙髓內(nèi)可以快速增殖并且具有一定克隆形成能力的牙髓細胞命名為DPSC，研究人員應用酶消化法對成人第三磨牙的牙髓細胞進行培養(yǎng)，并與骨髓間充質(zhì)干細胞進行比較，結果顯示：這兩種細胞具有極為相似的免疫學特性，并且，該研究進一步證實DPSC經(jīng)體外誘導后，可形成高密度的鈣化小結，將DPSC與羥基磷灰石/磷酸三鈣(HA/TCP)支架復合后移植到小鼠背側皮下，經(jīng)過一段時間后，能觀察到類似于牙本質(zhì)-牙髓復合體樣的結構。

2 DPSC的多向分化潛能

作為一種成體干細胞，DPSC具備多向分化的潛能，這種潛能不僅僅局限在骨性分化方面，研究人員在成脂分化、神經(jīng)分化等方面均取得了一定的研究成果，在再生醫(yī)學研究領域有著重要的指導意義。

2.1 DPSC的骨性分化 DPSC的骨性分化是關于DPSC定向分化研究較早的一項內(nèi)容，近些年來，又有了進一步的發(fā)展。Mori等〔4〕采用成骨分化培養(yǎng)基進行對DPSC的骨性誘導分化，結果發(fā)現(xiàn)，某些典型成骨細胞基因，如：堿性磷酸酶、I型膠原、骨橋蛋白等均大量表達;應用微陣列及RT-PCR技術進一步研究發(fā)現(xiàn)，在成骨分化過程中，胰島素樣生長因子結合蛋白5基因(IGFBP-5)、JunB原癌基因(JUNB)和核受體相關基因(NURR1)均發(fā)生表達上調(diào)現(xiàn)象，這一機制在成骨分化過程中有著重要的意義。D'Alimonte等〔5〕在人源DPSC正常成骨誘導過程中，加入血管內(nèi)皮生長因子，結果顯示：這種方法可以刺激DPSC的增殖分裂的速度加快，而且促進了成骨分化的進程。

2.2 DPSC的神經(jīng)分化 DPSC來源于胚胎時期的神經(jīng)脊，在神經(jīng)分化方面具備一定的潛能。Király等〔6〕采用低溫損傷的方法制備3日齡Wistar大鼠腦缺損模型，于顱內(nèi)注入DPSC進行修復，研究發(fā)現(xiàn)：DPSC趨向分布于室下區(qū)、胼胝體下區(qū)等神經(jīng)系統(tǒng)祖細胞區(qū)，并表達微管蛋白(N-tubulin)、膠質(zhì)原纖維酸性蛋白(GFAP)等神經(jīng)細胞標志，對損傷部位有一定的修復作用，并且具有神經(jīng)系統(tǒng)相關細胞的電壓依從性。因此，該結果進一步顯示，DPSC在腦損傷體內(nèi)修復方面，可以作為一種有效的修復細胞。Kara?z等〔7〕研究表明：DPSC不僅可以分化為神經(jīng)干細胞，而且在分化能力方面，高于傳統(tǒng)的骨髓間充質(zhì)干細胞。

2.3 DPSC的成脂分化 除成骨分化、神經(jīng)分化方面，成脂分化也是DPSC的一項重要潛能。Nozaki等〔8〕于成脂培養(yǎng)基中加入胰島素、地塞米松等誘導成脂，經(jīng)過一段時間的作用，可見細胞中有脂滴的形成，并且在分化過程中多能性標記轉錄因子(Oct3/4、Sox2)均呈現(xiàn)下調(diào)趨勢，Nanog基因無顯著變化;通過基因微陣列分析，研究人員進一步發(fā)現(xiàn)：過氧化物酶體增生物激活受體信號通路的多種組分，均發(fā)生變化。所以，對這些基因的調(diào)控，在細胞成脂分化過程中有著重要意義。

3 DPSC的分化誘導因素

在細胞分化的過程中，分化方向、分化程度、分化速度均會受到一系列物化因素、生物因素的影響，協(xié)調(diào)各方面因素對控制細胞定向分化有著重要意義。Ito等〔9〕將犬類的DPSC與不同的支架材料相結合，并用這種結合物治療骨缺損，結果發(fā)現(xiàn)不同的支架材料，修復效果會有較大差異，其中DPSC/富血小板血漿(PRP)復合物具備較好的修復效果。Galler等〔10〕將DPSC接種于水凝膠支架上，并將復合物移植到經(jīng)過次氯酸鈉(NaClO)、乙二胺四乙酸(EDTA)處理過的牙本質(zhì)內(nèi)部，培養(yǎng)6 w后，發(fā)現(xiàn)經(jīng)NaClO處理的牙本質(zhì)與復合物結合較好，接觸面形成大量細胞陷窩;經(jīng)乙二胺四乙酸(EDTA)處理的牙本質(zhì)可以誘導進一步DPSC向成牙質(zhì)細胞分化，進一步表達牙本質(zhì)涎蛋白，提高牙本質(zhì)的修復速度。Yang等〔11〕以大鼠DPSC為研究對象，在常規(guī)成骨分化培養(yǎng)基中添加白細胞介素β(IL-1β)，結果顯示，細胞的骨唾液蛋白、牙本質(zhì)基質(zhì)蛋白等礦化物質(zhì)的表達均上調(diào)，體內(nèi)實驗也得到了相似結果，可見，IL-1β在成骨礦化過程中有一定的促進作用。骨形態(tài)發(fā)生蛋白在誘導成骨方面有著重要作用，Liu等〔12〕分離擴增家兔DPSC后，將這種種子細胞接種在羥基磷灰石、膠原等支架材料上，并用骨形態(tài)發(fā)生蛋白II進行刺激處理，結果成骨速度明顯提高，最后制備的復合物更有利于體內(nèi)移植和組織修復。

4 DPSC的重編程與再分化

2006 年，Takahashi等〔13〕將4 個轉錄因子(Oct4，Sox2，cMyc和Klf4)導入已處于終末分化狀態(tài)的小鼠成纖維細胞中，從而獲得了一種類似于胚胎干細胞的多能性細胞，稱為“誘導性多能干細胞”(induced pluripotent stem cells，iPS cells)。這種方法可以非常穩(wěn)定的制造多能干細胞，引起了極大的關注。繼此之后，人類體細胞被成功誘導為iPS的報道〔14〕和老年人皮膚成纖維細胞被誘導為iPS細胞亞群的報道〔15〕相繼出現(xiàn)，這種細胞被認為是一種極具前景的干細胞。體細胞通過一定誘導方式，轉變?yōu)閕PS細胞亞群的過程稱為“重編程”;iPS經(jīng)過定向誘導，再次分化為其他種類細胞的過程，稱為“再分化”。

DPSC作為一種可以快速自我更新的成體干細胞，同樣具備重編程和再分化的潛能。Yan等〔16〕采用逆轉錄病毒介導法，將4個因子(Lin28/Nanog/Oct4/Sox2或c-Myc/Klf4/Oct4/Sox2)導入DPSC中，將DPSC重編程為iPS細胞亞群。DPSC來源的iPS細胞亞群表達階段特異性胚胎抗原-4(SSEA-4)、腫瘤壞死因子受體相關蛋白(TRA)-1-60、TRA-1-80、TRA-2-49、Nanog、Oct4、Sox2等表面標記，具備多向分化的潛能，可分化成3個胚層的組織，而且可被定向誘導分化為神經(jīng)干細胞和神經(jīng)元。Tamaoki等〔17〕對多株DPSC進行重編程誘導，結果顯示不同株的DPSC在重編程效率方面會有很大差別，不同株DPSC來源的iPS細胞亞群的再分化能力也有較大不同。因此，建立一種高效安全的重編程模式和再分化方法，仍是干細胞領域的研究熱點。

5 展望

在口腔醫(yī)學研究領域，DPSC的分離提取較為方便，常常可以通過分離某些牙源廢物的髓質(zhì)成分獲得。因此，該細胞在分離培養(yǎng)方面的便宜性以及本身具有的多向分化潛能、自我更新能力，均在很大程度上決定了該細胞在再生醫(yī)學中的廣泛應用前景。但是，關于DPSC諸多方面的研究尚處于起步階段，特別是在體內(nèi)應用性研究方面，仍需進一步探索。所以，只有建立一種高效穩(wěn)定、安全可靠的DPSC的應用模式，這種成體干細胞才能真正走進臨床，服務于人類。

1 Kim BC，Bae H，Kwon IK，et al.Osteoblastic/cementoblastic and neural differentiation of dental stem cells and their applications to tissue engineering and regenerative medicine〔J〕.Tissue Eng Part B Rev，2012.

2 Mori G，Brunetti G，Oranger A，et al.Dental pulp stem cells：osteogenic differentiation and gene expression〔J〕.Ann N Y Acad Sci，2011;1237：47-52.

3 Gronthos S，Mankani M，Brahim J，et al.Postnatal human dental pulp stem cells(DPSCs)in vitro and in vivo〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA，2000;97(25)：13625-30.

4 Mori G，Brunetti G，Oranger A，et al.Dental pulp stem cells：osteogenic differentiation and gene expression〔J〕.Ann N Y Acad Sci，2011;1237：47-52.

5 D'Alimonte I，Nargi E，Mastrangelo F，et al.Vascular endothelial growth factor enhances in vitro proliferation and osteogenic differentiation of human dental pulp stem cells〔J〕.J Biol Regul Homeost Agents，2011;25(1)：57-69.

6 Király M，Kádár K，Horváthy DB，et al.Integration of neuronally predifferentiated human dental pulp stem cells into rat brain in vivo〔J〕.Neurochem Int，2011;59(3)：371-81.

7 Kara?z E，Demircan PC，Sa?lam O，et al.Human dental pulp stem cells demonstrate better neural and epithelial stem cell properties than bone marrow-derived mesenchymal stem cells〔J〕.Histochem Cell Biol，2011;136(4)：455-73.

8 Nozaki T，Ohura K.Gene expression profile of dental pulp cells during differentiation into an adipocyte lineage〔J〕.J Pharmacol Sci，2011;115(3)：354-63.

9 Ito K，Yamada Y，Nakamura S，et al.Osteogenic potential of effective bone engineering using dental pulp stem cells，bone marrow stem cells，and periosteal cells for osseointegration of dental implants〔J〕.Int J Oral Maxillofac Implants，2011;26(5)：947-54.

10 Galler KM，D'Souza RN，F(xiàn)ederlin M，et al.Dentin conditioning codetermines cell fate in regenerative endodontics〔J〕.J Endod，2011;37(11)：1536-41.

11 Yang XC，Zhang SY，F(xiàn)an MW，et al.Effects of interleukin-1β on mineralization potential of dental pulp stem cells〔J〕.Zhonghua Kou Qiang Yi Xue Za Zhi，2011;46(7)：406-11.

12 Liu HC，E LL，Wang DS，et al.Reconstruction of alveolar bone defects using bone morphogenetic protein 2 mediated rabbit dental pulp stem cells seeded on nano-hydroxyapatite/collagen/poly(L-lactide)〔J〕.Tissue Eng Part A，2011;17(19-20)：2417-33.

13 Takahashi K，Yamanaka S.Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors〔J〕.Cell，2006;126(4)：663-76.

14 Takahashi K，Tanabe K，Ohnuki M，et al.Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors〔J〕.Cell，2007;131(5)：861-72.

15 Dimos JT，Rodolfa KT，Niakan KK，et al.Induced pluripotent stem cells generated from patients with ALS can be differentiated into motor neurons〔J〕.Science，2008;321(5893)：1218-21.

16 Yan X，Qin H，Qu C，et al.iPS cells reprogrammed from human mesenchymal-like stem/progenitor cells of dental tissue origin〔J〕.Stem Cells Dev，2010;19(4)：469-80.

17 Tamaoki N，Takahashi K，Tanaka T，et al.Dental pulp cells for induced pluripotent stem cell banking〔J〕.J Dent Res，2010;89(8)：773-8.