重組人生長停滯特異性蛋白6對缺氧/復氧原代心肌細胞及H9c2細胞損傷的影響

符江琳 劉承云 徐 曉 (華中科技大學同濟醫學院附屬協和醫院老年科，湖北 武漢 442000)

生長停滯特異性蛋白6(Gas6)的受體酪氨酸激酶亞家族成員，除表達于多種腫瘤細胞外，還廣泛存在于哺乳動物的心腦血管組織中〔1，2〕。以往認為Gas6因子及其受體作用主要抑制腫瘤細胞凋亡，近年來Gas6抑制非腫瘤細胞凋亡的研究日益增多〔3，4〕，最新研究顯示在肝臟缺血再灌注損傷中，Gas6對肝細胞起保護作用〔5〕，但目前關于Gas6對心肌細胞凋亡影響的報道少見。我們前期實驗已發現Gas6及其受體基因均高表達于缺血再灌注大鼠心臟組織中。抑制心肌細胞凋亡對于保護圍心臟手術、急性心肌梗死及慢性心衰等常見老年病患者有著重大意義。本實驗初步探討外源Gas6(rhGas6)對缺血再灌注誘導的心肌細胞損傷是否有保護作用，為常見老年病提供可能的臨床心肌保護治療思路。

1 材料與方法

1.1 細胞來源 新生1～3 d的Wistar大鼠(華中科技大學同濟醫學院動物中心提供)。H9c2細胞系購于武漢博士德公司。

1.2 主要試劑 重組人Gas6(R＆D公司)，AnnexinV/PI凋亡試劑盒(AntiGene公司)，DMEM高糖和低糖型培養基(Gibco公司)，混合Ⅱ型膠原酶(Sigma公司)，胎牛及小牛血清(杭州四季青公司)，乳酸脫氫酶檢測試劑盒及Caspase-3活性檢測試劑盒(南京建成有限公司)，5-Brdu(武漢博士德公司)，其他試劑均為國產分析純。

1.3 實驗方法

1.3.1 原代心肌細胞分離及H9c2細胞系培養 參閱相關文獻中方法〔6〕，取出生1～3 d的Wistar乳鼠，無菌條件下取心臟組織，剝離非心肌組織，冰浴PBS漂洗3～4次后，剪成1 mm3組織碎塊，加入5倍體積的0.05%胰蛋白酶及0.025%膠原酶1∶1混合消化液，37℃ 水浴消化4～5次，收集上清細胞，加入等體積的20%小牛血清的高糖DMEM培養液終止消化，200目濾網過濾細胞懸液，1 000 r/min離心10 min，棄上清，加入含10%胎牛血清的高糖DMEM培養基制成細胞懸液培養，37℃、5%CO2培養箱中孵育90 min，取懸液接種于培養板培養，取培養3 d的呈單層網狀結構，搏動頻率達100次/min左右心肌細胞進行實驗。H9c2細胞系以(1～2)×104/ml接種于50 ml培養瓶中，用含10%胎牛血清的高糖DMEM培養基，37℃、5%CO2培養箱(95%空氣)中培養，2～3 d用0.25%胰酶消化傳代1次，接種于培養板中，取對數生長期細胞，密度達 90%進行實驗。

1.3.2 心肌細胞H/R模型的構建及實驗分組 參照Pi等〔7〕方法稍加改進，無血清低糖DMEM培養基，事先用氮氣充分飽和30 min，流量為2 L/min，使溶解氧分壓從20 kPa降至4 kPa。將上述細胞培養基快速置換掉細胞培養板中的含血清的高糖培養基，并將細胞培養板置入密閉裝置內，充滿氮氣，37℃，原代心肌細胞培養3 h后將培養基換為正常培養基，37℃、5%CO2培養箱(95%空氣)復氧3 h。H9c2細胞系培養2 h后將培養基換為正常培養基，復氧3 h。分別取正常培養的原代心肌細胞及H9c2細胞系隨機分3組：①正常組;37℃、5%CO2培養箱(95%空氣)正常培養;②缺氧/復氧組(H/R組);按照上述構建模型培養;③缺氧/復氧+rhGas6組(rhGas6組);于缺氧前15 min在無血清低糖培養基中加入終濃度為100 ng/ml的重組人rhGas6，構建模型。每個組含6個樣本。

1.3.3 心肌細胞形態學觀察 在倒置顯微鏡下觀察心肌細胞形態及自發搏動情況。

1.3.4 MTT法測定心肌細胞活力 取原代心肌細胞及H9c2細胞，將細胞密度分別調至1×105/ml、1×104/ml，取 200 μl/孔接種于96孔培養板中，2～3 d后隨機分組對應處理后，每孔加入20 μl MTT(5 mg/ml)，繼續正常培養4 h后，1 000 min×5 min離心后棄上層培養液，每孔加入 DMSO 0.15 ml，震蕩10 min后，酶標儀檢測各孔吸光度A值(檢測波長為570 nm)。細胞存活率=實驗組吸光值/對照組吸光值×100%。

1.3.5 乳酸脫氫酶(LDH)的檢測心肌細胞損傷程度 原代心肌細胞及H9c2細胞分別以(1～2)×106/ml、(2～4)×105/ml密度接種于6孔培養板中，2～3 d后隨機分組對應處理后，各組6孔板中培養液，依照試劑盒說明書，反應后利用721分光光度計檢測A值，根據A值按說明書公式計算出LDH活力。

1.3.6 Caspase-3活性檢測 取處理過的各組6孔板，先將細胞培養液收集于離心管中，用0.25%的胰酶消化貼壁細胞，收集于對應的離心管中，按照Caspase-3活性檢測試劑盒說明書步驟，用酶標儀測定各組的A405值，樣品的A405扣除空白對照組A405，即為Caspase-3催化產生的pNA的吸光值。根據測定出的標準曲線，算出對應酶活力單位(UI)(每組6個復孔)。

1.3.7 AnnxinV-FITC/PI雙標法檢測心肌細胞凋亡 取處理過的各組6孔板，先將可能含有漂浮凋亡細胞的各組培養液分別收集于流式管中，用胰酶消化貼壁細胞，并收集于對應的流式管中，4℃、1 000 r/min離心5 min，用冰預PBS洗滌2次，然后用200 μl結合緩沖液重懸細胞。加入5 μl AnnexinV-FITC，避光室溫反應15 min，再加入10 μl PI避光室溫反應5 min或者4℃反應30 min，加入250 μl PBS，立即上機檢測。經流式細胞儀分析結果。

2 結果

2.1 心肌細胞生長情況及心肌細胞搏動頻率 分離純化原代乳鼠心肌細胞接種于培養板中，倒置顯微鏡下觀察，4 h后心肌細胞開始貼壁生長，12 h后逐漸伸展由圓形變為梭形。24 h后90%細胞貼壁呈梭形，少數單個細胞呈現不同頻率的自發性搏動，搏動頻率為60～80次/min。48 h后細胞逐漸向四周擴展呈星型，90%波動明顯，頻率大概在90～100次/min。72 h后，正常l組細胞生長良好、成簇生長，搏動明顯且節律規則;H/R組細胞偽足縮短或消失、折光性下降、搏動頻率(35±7)次/min較正常組(94±3)次/min明顯下降(P＜0.05);與H/R組相比，rhGas6組細胞生長較好，搏動頻率增加(78±6)次/min，差異具有統計學意義(P＜0.05);而rhGas6組較正常組細胞搏動頻率改變不明顯。

2.2 各組心肌細胞存活率的比較 比較原代乳鼠心肌細胞及H9c2細胞各組OD值，與正常組比較，H/R組細胞損傷嚴重，細胞活力明顯降低，兩組比較差異有明顯的統計學意義;rh-Gas6組與H/R組相比細胞活力明顯升高(P＜0.05)，但與正常組比較差異無統計學意義(P＞0.05)。見表1。

2.3 LDH活力測定的比較 在原代心肌細胞及H9c2細胞中，H/R組較正常組、rhGas6組 LDH釋放明顯增加，H/R+rh-Gas6組與H/R組相比，差異有明顯統計學意義(P＜0.05)，但與正常組比較差異無統計學意義(P＞0.05)。見表1。

2.4 Caspase-3活性檢測 正常組細胞Caspase-3活性較低;H/R組活性較正常組增加;rhGas6組活性較H/R組減低(P＜0.05)。見表2。

2.5 各組細胞凋亡率的比較 rhGas6組、正常組凋亡率明顯低于H/R組(P＜0.05)，rhGas6組與正常組凋亡率差異無統計學意義。見表2。

表1 原代心肌細胞及H9c2細胞各組細胞存活率和LDH活性變化( s，n=6)

表1 原代心肌細胞及H9c2細胞各組細胞存活率和LDH活性變化( s，n=6)

與正常組比較：1)P＜0.05;與H/R組比較：2)P＜0.05，下表同

LDH(UI)PCM H9c2組別 存活率(%)PCM H9c2細胞94.2±3.3 91.0±4.0 81.50±5.94 61.89±10.16 H/R組 48.5±4.01)43.2±3.51)206.67±16.311)193.83±17.251)rhGas6組 83.5±3.62)82.1±4.32)107.22±8.772)110.67±11.722)細胞正常組

表2 原代心肌細胞及H9c2細胞各組細胞Caspase-3變化( s，n=6)

表2 原代心肌細胞及H9c2細胞各組細胞Caspase-3變化( s，n=6)

3.23±0.41 3.02±0.44 2.83±0.42 2.65±0.48 H/R組 10.19±0.781) 8.86±0.701) 14.51±0.821) 12.16±0.681)rhGas6組 5.17±0.642) 4.63±0.502) 5.17±0.642) 5.58±0.532)細胞正常組組別 Caspase-3 PCM H9c2細胞凋亡率(%)PCM H9c2

3 討論

細胞凋亡在急性心肌梗死、急慢性心力衰竭及糖尿病心肌病等眾多心血管疾病中發揮著重要的病理生理學作用，尤其在急性心肌梗死早期再灌注治療中，細胞凋亡不但影響心肌的梗死面積，還促成心臟結構的重構〔8〕。雖然凋亡的發生是不可逆的，但有大量研究表明細胞凋亡受一些生長因子或炎性細胞因子的調節，同時干擾或中斷引起凋亡的信號傳導途徑，可能對治療心血管疾病有重要的臨床意義。

Gas6因子能與多種腫瘤細胞表面表達的Axl受體結合發揮多種生物學效應，如調節細胞存活、增殖、遷移、黏附和吞噬等作用。近些年研究發現，Gas6能夠抑制多種非腫瘤細胞的凋亡，尤其在高糖誘導的血管平滑肌細胞凋亡、缺血的大腦皮層誘導的神經元細胞凋亡及肝臟缺血再灌注損傷中，Gas6起著顯著的保護作用〔3～6，9〕。這些都預示著Gas6可能在老年人常見心腦血管疾病中有一定的保護作用。

以往研究顯示Gas6可能通過以下主要途徑抑制細胞凋亡：①抑制Caspase-3活性。多種藥物以及細胞因子介導的抗細胞凋亡作用中，Caspase-3 都充當著重要角色〔10，11〕。因而Caspase-3活性的測定成為相關疾病基礎研究和藥物干預效果評價的重要指標。已有研究表明Gas6可通過降低促凋亡蛋白Caspase-3活性，保護血清剝奪誘導的人臍靜脈內皮細胞凋亡〔5〕。且在他汀類藥物通過Gas6介導的存活通路阻止血管鈣化過程中，Caspase-3活性也明顯降低，凋亡的血管平滑肌細胞數目減少〔12〕;②激活抗凋亡蛋白 NF-κB、Bcl-2，通過激活NF-κB的死亡受體途徑介導。在不少腫瘤細胞中，Gas 6能誘導NF-κB結合活性和轉錄活性以及使Bcl-2蛋白水平的快速而短暫的升高〔13〕。③抑制細胞鈣內流。早有報道，在β淀粉樣蛋白誘導的原代大鼠皮層神經元凋亡過程中，Gas6可以抑制L型鈣通道，達到神經保護作用。

我們前期的研究顯示Gas6及其受體基因高表達于缺血再灌注大鼠心肌組織，提示Gas6可能有心肌保護作用。本實驗提示Gas6可能通過減少細胞膜通透性來提高心肌細胞存活率及抑制Caspase-3活化發揮抗細胞凋亡作用，進而減少心肌損傷。另外本實驗利用混合膠原酶及5-Brdu分離并培養原代心肌細胞，基本剔除了Gas6對心肌成纖維細胞的作用因素。更重要的是利用體外培養的H9c2心肌細胞系，排除了體內各種體液因素對實驗的干擾。

前人及我們的研究均顯示Gas6能夠抑制非腫瘤細胞的凋亡，但Caspase-3作為多種胞內凋亡信號轉導的下游通路，Gas6具體是如何通過調節上游網絡信號通路抑制心肌細胞凋亡，有待進一步研究。我們分別在原代乳鼠心肌細胞和H9c2細胞系這兩種不同的心肌細胞中，驗證了Gas6可以減少缺血再灌注誘導的心肌細胞損傷，通過抑制Caspase-3活性減少細胞凋亡，這可能為今后老年患者的缺血性心腦血管疾病的防治提供新的治療思路。

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