鐮形棘豆總黃酮軟膏劑的制劑工藝研究

陳志鵬，瞿敏明，劉丹，肖衍宇，蔡寶昌*，陳新梅

(1.南京中醫藥大學，江蘇省中藥炮制重點實驗室，江蘇南京210029;2.中國藥科大學，江蘇南京210009;3.山東中醫藥大學，山東濟南250355)

鐮形棘豆Oxytropis falcata Bunge是豆科棘豆屬的多年生無莖草本植物，藏藥名為“俄達夏”，具有消炎鎮痛、生肌愈瘡、止血等功效，在臨床上廣泛應用于治療痛風、濕痹、“岡巴”、瘡癤腫痛、骨傷疼痛等，是藏醫“三消炎藥”之一，被稱為“草藥之王”［1］，是奇正消痛貼膏、青鵬膏劑、藏奇神風濕貼、奇正藏貼、萬痛筋骨帖、藏藥奇正貼、風骨1號、藏紅花油等數十種藏藥復方或藏成藥的主要藥物。本課題組前期研究結果表明其總提物口服有一定的鎮痛抗炎活性［2］，有效部位篩選其總黃酮部位口服具有明顯的抗炎鎮痛活性［3］，但其生物利用度較低［4］。本研究的目的是以鐮形棘豆的主要成分2'，4'-二羥基查爾酮(2'，4'-dihydroxychalcone，TFC)為指標性成分［5］(TFC在鐮形棘豆中為主要活性成分，其抗菌［6］、抗氧化［7］、抗腫瘤［8］作用顯著)，以其體外累積透過量為指標，嘗試將鐮形棘豆總黃酮制備為軟膏劑，在單因素考察的基礎上優化總黃酮軟膏劑處方，以期得到滲透性能良好的鐮形棘豆總黃酮軟膏劑，達到提高其生物利用度的目的，為進一步的研究奠定基礎。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Varian 920-LC高效液相色譜儀(美國Agilent公司);RYJ-6A型藥物透皮擴散儀(上海黃海藥檢儀器廠);SHZ-88臺式水浴恒溫振蕩器(江蘇太倉市實驗設備廠);CZX-9140MBE型高速離心機(上海博迅實業有限公司醫療設備廠);AG-285電子天平(瑞典METTLER公司)。

1.2 材料

TFC，由本實驗室自制，經熔點測定、UV、1HNMR和13C-NMR等確定其結構，HPLC測定其純度大于98.0%;色譜純乙腈(德國CNW公司)，其他試劑為分析純。SD大鼠，180～220 g，雄性，由南京中醫藥大學動物實驗中心提供。

1.3 總黃酮的制備方法與定量測定

稱取100.0 g藥材粉末，加入1 L無水乙醇于室溫下超聲提取3次，每次60 min，藥渣再用50%乙醇超聲提取3次，每次60 min，減壓濾過，收集所有濾液并于50℃下減壓濃縮成浸膏，加入2%氫氧化鈉水溶液，超聲促溶解，減壓濾取堿水液，重復溶解多次至濾液近無色，合并所有堿水液，用1%鹽酸溶液調節至pH5，依次用三氯甲烷和乙酸乙酯萃取各6次，合并萃取液，50℃下減壓濃縮至小體積后，轉入潔凈并已稱定質量的蒸發皿中，于80℃水浴中加熱揮干溶劑，再次稱定質量，總黃酮得率2.4%。

總黃酮測定以蘆丁為標準品，采用紫外吸光度標準曲線法，計算樣品中黃酮的質量分數為83.7%;采用HPLC標準曲線法測定總黃酮有效組分中TFC的質量分數為6.07%。

2 方法與結果

2.1 體外透皮皮膚的處理

取體質量(200±20)g健康大鼠，采用機械脫毛法，剝離腹部皮膚，去除皮下脂肪層及黏液組織，用無菌生理鹽水洗凈后，冷藏備用。

2.2 體外透皮實驗方法的建立

2.2.1 將鐮形棘豆總黃酮溶液或乳膏劑均勻涂抹于預處理動物的皮膚。將皮膚固定于改進的Franz擴散池的供藥池，角質層面朝向供藥池。在接受室中注入接受液，液面恰與皮膚內層接觸，開動電磁攪拌器恒速攪拌和恒溫水浴(37±0.5)℃，在設定時間點取樣1 mL，置于離心管中。每次取樣后均補加相同體積的新鮮接受液并排除接收室中的氣泡，樣品溶液用HPLC法測定吸收值，計算TFC的質量濃度，并按下式計算累積透過量:

其中，Cn校:n點的校正藥物質量濃度;Cn測:n點實際測得的的藥物質量濃度;∑n－1Ci:該取樣點前各點的測定質量濃度之和;V0:接受池中接受液的體積;V:取樣量;Qn:n點時藥物單位體積的累積釋藥量;A:擴散池橫截面積;C載藥:載藥質量濃度;Cd:供給池中供試液藥物質量濃度。

計算累積滲透量Qn，并計算累積滲透率Qn%，比較不同透皮實驗的累積透過量Q%，確定合適的實驗方法與制劑配比。

2.2.2 HPLC法測定TFC的色譜條件［3］漢邦ODS-2色譜柱(4.6 mm×250 mm，4.5 μm);檢測波長365 nm;柱溫28℃;流動相為乙腈－0.1%甲酸水溶液(60∶40);體積流量1.0 mL/min;檢測波長365 nm;進樣量10 μL。

2.3 體外透皮方法學考察

2.3.1 標準曲線的繪制精密稱取5.35 mg TFC標準品置于5 mL棕色量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密移取1 mL于5 mL棕色量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，得21.4 μg/mL的TFC貯備液。精密吸取貯備液0.1，0.125，0.25，0.5，1，2 mL，置于10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，得到稀釋成0.214，0.268，0.535，1.07，2.14，4.28，21.4 μg/mL的標準品溶液。按照2.2.2項下方法進樣測定。以峰面積(Y)為縱坐標，進樣量(X，ng)為橫坐標進行線性回歸，計算得到線性回歸方程:Y=0.061 2X－3.621 5，r=0.999 9，線性范圍:214～21 400 ng/mL。

2.3.2 體外透皮接收液的篩選由于鐮形棘豆總黃酮溶解性較差，為滿足漏槽條件，我們對常見接受液進行飽和溶解度的測定。結果見表1。故選用PES［PEG400-乙醇-生理鹽水(20∶30∶50)］作為體外透皮實驗的接收液。將累積滲透量Q對時間t進行線性回歸得到Q=2.160 5t+4.839 7，得透皮速率常數Js=2.160 5 μg/(cm2·h)。

表1 鐮形棘豆總黃酮中TFC在不同介質中的溶解度(μg/mL)(n=3)Tab.1 The solubility of TFC in different solvent(μg/mL)(n=3)

2.4 軟膏劑處方單因素考察

2.4.1 軟膏劑的制備稱取處方量的硬脂酸、單硬脂酸甘油酯、蓖麻油和羊毛脂為油相，置于蒸發皿中，于水浴上加熱至80℃左右混合熔化。另將三乙醇胺和蒸餾水置燒杯中，于水浴上亦加熱至80℃左右。在等溫下將水相緩緩倒入油相中，并于水浴上不斷攪拌至呈乳白色半固體狀，在室溫下攪拌至近冷凝。

溶液劑的制備:鐮形棘豆總黃酮有效組分溶于40%乙醇作為溶液劑試藥，藥物質量濃度為1.028 mg/mL，將1 mL試藥溶液緩慢加入供給室皮膚表面。

2.4.2 載藥量對軟膏劑體外累積透皮率的影響制備含有不同藥物質量分數(選取0.5%、1%和5%，w/w)的鐮形棘豆總黃酮軟膏劑，并進行體外累積透皮率實驗，計算軟膏劑的累積透皮率。結果如圖1所示。

圖1 含不同質量分數藥物溶液體外透皮累積透過率(n=3)Fig.1 Penetration cumulative percentage of different concentrations of drugs in vitro transdermal permeability(n=3)

2.4.3 促滲劑的種類對鐮形棘豆軟膏劑累積透過量的影響分別制備含有促滲劑氮酮、龍腦、油酸1%的軟膏劑，并進行累積透皮率實驗，計算3種促滲劑對軟膏劑中TFC的累積透過率的影響。結果見圖2。

2.4.4 乳化劑配比對體外累積透皮率的影響制備單硬脂酸甘油酯與三乙醇胺的配比分別為15∶1、30∶1、45∶1的軟膏劑，并進行累積透皮率實驗，考察乳化劑配比對軟膏劑中TFC的累積透過率的影響，結果見圖3。

圖2 不同促滲劑對軟膏劑中TFC的體外透皮累積透過率的影響(n=3)Fig.2 Effect of different penetration enhancers on transdermal ointment in the TFC transmission of the cumulative(n=3)

圖3 不同乳化劑配比對體外累積透皮率的影響(n=3)Fig.3 Effect of different emolsifier matching on transdermal ointment in the TFC transmission of the cumulative(n=3)

2.4.5 利用正交設計優化軟膏劑處方以促滲劑油酸用量、載藥濃度、單硬脂酸甘油酯和三乙醇胺配比三個因素為考察指標，每個因素設置三個水平，以體外透皮累積透過率為考察指標，選用L9(34)進行正交試驗，見表2。軟膏劑處方篩選結果見表3、4，最優促滲效果的處方為油酸(1%)、載藥濃度(0.5%)、單硬脂酸甘油酯-三乙醇胺(30∶1)。

2.5 總黃酮軟膏劑的體外透皮實驗鐮形棘豆總黃酮溶于40%乙醇作為溶液劑試藥，將1 mL試藥溶液緩慢加入供給室皮膚表面;軟膏劑按照2.4.1項優化處方制得，將100 mg試藥均勻涂抹在供給室皮膚表面，分別在0.5、1、2、4、6、8、10、18、24、26、30h取樣，按照2.2.2項方法測定TFC并計算溶液劑與軟膏劑的累積透皮率，結果見圖4。

表2 因素水平Tab.2 Experiment scheme of the orthogonal design

表3 正交實驗結果Tab.3 Experiment scheme of the orthogonal design

表4 方差分析Tab.4 The analysis of variance

圖4 溶液劑與軟膏劑體外透皮累積透皮率比較(n=3)Fig.4 Penetration cumulative percentage of solutions and ointments(n=3)

3 討論

3.1 實驗中油酸促滲的效果在1%時最佳，可能與油酸促滲的機理有關［9］，一般認為油酸與皮膚中的脂肪酸有相似的結構，使角質層細胞間類脂分子排列發生變化，增加類脂的流動性，在油酸增加到一定濃度后，其改變類脂分子的變化的能力降低，抑制了藥物透皮的效果。在體外透皮實驗中，由于累積透過效果明顯，故沒有在實驗中選擇復合促滲劑進行篩選。

3.2 有文獻報道，體外透皮實驗中，以有效部位中主要成分作為透皮性能篩選指標能一定程度上反映該有效部位的透皮性能［10］。本課題前期研究總黃酮有效組分的不同劑量鎮痛抗炎藥理活性實驗中，結合不同劑量藥動學實驗發現，TFC在體內的血藥濃度與其鎮痛抗炎藥理活性具有劑量相關性，因此體外透皮以TFC作為考察試藥總黃酮的透皮性能具有可行性。

3.3 實驗中不同濃度藥物體外透皮實驗的結果表明含藥1%的試藥釋放最完全，實驗中采用累積透過率作為考察指標，出現了藥物累積透過率不以濃度為依賴的結果，而藥物累積透過量依然為5%試藥濃度最高，這一結果與藥物濃度為體外透皮主要影響因素并不矛盾。有文獻報道［11］高濃度的藥物可能對自身透皮有阻礙作用，也有可能藥物的滲透系數與濃度的變化呈非線性關系［12］。

3.4 載藥量考察中主要參考溶液劑在經皮給藥藥理實驗中的體積分數［13］，選取0.5%～5%的范圍考察其體外透皮特性。

4 結論

在單因素考察的基礎上，通過正交設計優化軟膏劑的處方。與溶液劑相比，鐮形棘豆總黃酮軟膏劑的體外透皮累積透皮率明顯增加，提示將中藥有效部位包裹于軟膏劑中可提高藥物滲透能力，有利于炎癥和疼痛等局部疾病的治療。

但是，本研究中對于制劑的考察指標較少，在今后的研究中將進一步研究制劑的穩定性、刺激性等，此外，雖然軟膏劑在體外具有良好的滲透能力，但是其在體內的性質有必要進一步的研究。

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