多指標(biāo)綜合評分法優(yōu)選腦通顆粒提取工藝

黃勇，張治蓉，喬希，王愛民，況時祥，王永林*

(1.貴陽醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，貴州貴陽550004;2.貴陽中醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院，貴州貴陽550001)

腦通顆粒處方原為貴陽中醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院臨床使用的醫(yī)院制劑方，臨床用于心脾氣虛，清陽不升，腦絡(luò)不利，腦髓失養(yǎng)，神機不用，屬現(xiàn)代輕度血管性老年癡呆范疇，治療效果良好。醫(yī)院制劑內(nèi)含大量生藥原粉，存在質(zhì)量不易控制、攜帶不便等缺點，特別是服用劑量過大，導(dǎo)致病人(尤其老年病患者)吞咽不便及胃腸道反應(yīng)。不利于本品的臨床推廣應(yīng)用。

本方由黃芪、水蛭、葛根、西洋參、天麻等藥味組成。君藥為黃芪，水蛭、葛根為臣，其余為佐使藥。根據(jù)方義，各藥味有其獨立而協(xié)作的功用，如以單一指標(biāo)成分進(jìn)行工藝優(yōu)選，不能保證本方的整體質(zhì)量［1-2］。因此，本實驗分別以黃芪、葛根、天麻和西洋參中的黃芪甲苷、葛根素、天麻素和人參皂苷Rb1轉(zhuǎn)移率作為考察指標(biāo)［3-6］，綜合評分研究本方的提取工藝，確定本品的最佳工藝參數(shù)，為制備質(zhì)量穩(wěn)定可控、臨床使用安全、有效、方便的劑型提供試驗依據(jù)。

1 儀器與試藥

Prominenece HPLC液相色譜儀系統(tǒng)(日本島津);Alltech ELSD 800蒸發(fā)光檢測器(美國奧泰科技公司);WYB-5000型全自動空氣泵(北京怡豐瑞普科技有限公司)等。藥材均購于貴陽市藥材市場，經(jīng)貴陽醫(yī)學(xué)院生藥教研室鑒定合格且均符合2010版中國藥典要求。黃芪甲苷(批號:110781-200613)、人參皂苷Rb1(批號:110704-200921)、天麻素(批號:110807-200205)、葛根素(批號:110752-200912)對照品均購自中國藥品生物制品檢定所。甲醇為色譜純，其他試劑均為分析純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 定量測定

2.1.1 黃芪甲苷和人參皂苷Rb1的測定［7］

2.1.1.1 色譜條件Eclipse XDB-C18色譜柱(4.6 mm×150 mm，5 μm);乙腈(A)-水(B)為流動相，梯度洗脫(0 min，25%A;15 min，30%A;35 min，35%A;40 min，80%A;42 min，25%A);柱溫為40℃，蒸發(fā)光散射檢測器(ELSD)，漂移管溫度40℃;霧化空氣壓力0.30 Mpa;進(jìn)樣量10 μL。理論板數(shù)按黃芪甲苷峰計算應(yīng)不得低于10 000。

2.1.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制精密稱取黃芪甲苷、人參皂苷Rb1對照品適量，加甲醇配置成質(zhì)量濃度分別為2.352、2.35 mg/mL的貯備液。分別精密吸取上述兩種對照品貯備液0.25、0.5、1、2、4 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，分別精密吸取10 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜，以峰面積Y的常用對數(shù)對進(jìn)樣濃度X的常用對數(shù)進(jìn)行線性回歸，得黃芪甲苷、人參皂苷Rb1線性回歸方程分別為Y=1.346X+6.965(r=0.998 9)、Y=1.628X+6.756(r=0.999 1)，線性范圍分別為0.058 8～0.940 8 mg/L、0.058 78～0.940 0 mg/mL。

2.1.1.3 供試品溶液的制備及測定精密吸取1至16號樣提取液適量，置蒸發(fā)皿中蒸至近干，殘渣加氨試液30 mL使溶解，用水飽和正丁醇提取4次，每次25 mL，合并正丁醇層，用正丁醇飽和的水50 mL提取，分取正丁醇層，至蒸發(fā)皿中蒸干，殘渣加甲醇溶解，移至5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，濾過即得。精密吸取各供試品溶液，按上述方法測定。

2.1.2 葛根素和天麻素的測定［7］

2.1.2.1 色譜條件Synergi 4u Hydro-RP 80 A色譜柱(4.6 mm×150 mm，4 μm Phenomenex公司);乙腈(A)-0.1%磷酸水(B)為流動相，梯度洗脫(0 min，3%A;3 min，5%A;5 min，11%A;20 min，14%A;22 min，100%A;27 min，3%A);溫度為40℃;檢測波長為220 nm;體積流量為1 mL/min;進(jìn)樣量10 μL。

2.1.2.2 線性考察分別精密稱取天麻素、葛根素對照品適量，加50%甲醇配置成質(zhì)量濃度為0.855 2、2.436 mg/mL的貯備液。分別精密吸取上述兩種對照品貯備液0.05、0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2 mL，置10 mL量瓶中，加50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，分別精密吸取10 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜。以峰面積(Y)對進(jìn)樣質(zhì)量濃度(X)為進(jìn)行線性回歸，得天麻素、葛根素線性回歸方程分別為Y=1.325×107X+3.132×103(r=0.999 7)，Y=2.026×107X-5.021×104(r=0.999 4)，線性范圍分別為0.004 276～0.273 6 mg/mL、0.012 18～0.779 5 mg/mL。

2.1.2.3 供試品溶液的制備及測定精密量取1至16號各提取液適量，加50%的甲醇定容至刻度，濾過即得。精密吸取各供試品溶液，按上述方法測定。

2.2 總固體物收得率的測定精密量取各個正交試驗號的提取液25 mL，濃縮至干，于105℃干燥至恒質(zhì)量后于干燥器中冷卻30 min，迅速精密稱定質(zhì)量。

2.3 提取工藝優(yōu)選根據(jù)該處方中各藥味主要藥效成分的性質(zhì)特點［8-10］，結(jié)合預(yù)實驗結(jié)果，對乙醇體積分?jǐn)?shù)(A)、乙醇/水用量(B)、提取次數(shù)(C)、提取時間(D)4個主要影響因素進(jìn)行考察。按L16(45)正交表進(jìn)行試驗，每個因素設(shè)定4個水平，以黃芪甲苷、葛根素、天麻素、人參皂苷Rb1轉(zhuǎn)移率和總固體得率為考察指標(biāo)，確定其最佳提取工藝參數(shù)。因素水平見表1。

按處方比例稱取(1/4)處方量藥材，按L16(45)正交試驗設(shè)計表的條件進(jìn)行試驗。5個指標(biāo)的權(quán)重系數(shù)均為0.2［11-13］。試驗結(jié)果及分析見表2～4。

表1 因素水平表

表2 正交試驗表

表3 方差分析表

方差分析結(jié)果表明(見表3)，乙醇體積分?jǐn)?shù)(A)、乙醇/水用量(B)對實驗結(jié)果影響極顯著(P＜0.001)，提取次數(shù)(C)、提取時間(D)對實驗結(jié)果的影響顯著(P＜0.05)，各影響因素由大到小排列是A＞B＞D＞C，其最佳工藝條件為A4B4C4D1。綜合方差分析與一致性子集(見表4)的分析結(jié)果，同時考慮大生產(chǎn)合理、節(jié)能降耗的要求，確定最佳工藝組合為A3B2C3D3條件。即方中藥材除水蛭外以8倍量75%乙醇回流提取2次，每次1 h;藥渣與水蛭加10倍量水煎煮2次，每次1 h。

表4 一致性子集表

2.4 驗證試驗根據(jù)正交試驗優(yōu)選的工藝條件，按腦通顆粒處方量稱取藥材，進(jìn)行3批驗證試驗，得黃芪甲苷、葛根素、天麻素、人參皂苷Rb1轉(zhuǎn)移率和總固體得率的平均值分別為81.44%、91.03%、81.21%、65.05%和30.24%，RSD值分別為2.25%、1.53%、0.90%、2.36%和2.62%。表明醇水雙提提取工藝穩(wěn)定、合理可行，可作為腦通顆粒的提取工藝。

3 討論

本實驗在前期確定提取溶媒和提取方法研究中，以藥效學(xué)試驗結(jié)合化學(xué)指標(biāo)成分的轉(zhuǎn)移情況為指標(biāo)考察了溶媒的使用。實驗結(jié)果表明，本方以水為主要溶媒，基本能將各藥味主要有效物質(zhì)群提取出來，而乙醇效果略差，主要藥效物質(zhì)既有水溶性部位、也有醇溶性部位。化學(xué)成分測定結(jié)果表明，水、醇單獨使用對方中各藥味化學(xué)成分的提取效率不及醇水雙提法，兩種溶劑同時使用增加了提取物質(zhì)群的極性跨度。同時運用LC-MS對不同提取方法提取的樣品的指紋圖譜進(jìn)行了研究，結(jié)果表明在試驗條件下，不同提取方法提取樣品指紋圖譜的峰形、峰數(shù)、峰高存在客觀差異，在一定程度反映了樣品中物質(zhì)的轉(zhuǎn)移情況，處方以醇水雙提指紋圖譜的色譜峰較豐富，峰強度較大，表明樣品中物質(zhì)的轉(zhuǎn)移較為充分。相關(guān)研究將在后續(xù)文獻(xiàn)中報道。

［1］張彤，徐蓮英，陶建生，等.多指標(biāo)綜合評分法優(yōu)選葛根提取工藝［J］.中草藥，2004，35(1):38-40.

［2］馬志國，代龍.首烏愈癱片提取工藝的研究［J］.中成藥，2009，31(9):1447-1449.

［3］溫燕梅.黃芪的化學(xué)成分研究進(jìn)展［J］.中成藥，2006，28(6):879.

［4］張東華，董強波，彭曙光.葛根的化學(xué)成分、藥理作用和臨床應(yīng)用研究［J］.首都醫(yī)藥研究，2007，14(6):44-45.

［5］郝小燕，譚寧華，周俊.黔產(chǎn)天麻的化學(xué)成分［J］.云南植物研究，2000，22(1):81-84.

［6］王蕾，王英平，許世泉，等.西洋參化學(xué)成分及藥理活性研究進(jìn)展［J］.特產(chǎn)研究，2007，29(3):73-77.

［7］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典:2010年版一部［S］.北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010:54-55，77-78，122-123，312-313.

［8］郭美華，張新建，楊麗杰，等.天麻有效成分的提取工藝研究［J］.中國藥物與臨床，2010，10(2):175-176.

［9］閻向東，侯志飛，袁驄沖，等.天冰調(diào)督膠囊提取工藝研究［J］.時珍國醫(yī)國藥，2010，21(8):1950-1952.

［10］馬立新，黃燕，余琰，等.二至膠囊提取工藝研究［J］.甘肅中醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2010，27(4):62-66.

［11］陳吉航，黃松，黃孟秋，等.多指標(biāo)綜合評分法優(yōu)選婦科栓劑的提取工藝［J］.中成藥，2010，32(3):508-511.

［12］付克，張坤，閆廣利.多成分評價優(yōu)化柴芩清肝方提取工藝研究［J］.中國實驗方劑學(xué)雜志，2010，16(7):10-12.

［13］任愛農(nóng)，高燃，田耀洲.多指標(biāo)綜合評分法優(yōu)選清清顆粒提取工藝［J］.中成藥，2008，30(7):1059-1062.