大孔樹脂純化穿心蓮內部沸騰提取液的工藝研究

彭夢微，韋藤幼，陳曉光，童張法

(廣西大學化學化工學院，廣西南寧530004)

穿心蓮Andrographis paniculata(Burm.F.)Nees為爵床科穿心蓮屬植物，藥用部位為其葉和梗，其有效成分穿心蓮內酯類化合物具有清熱解毒、涼血消腫等功效，對呼吸道感染、急性菌痢、腸胃炎、感冒發熱、糖尿病及癌癥等疾病［1～5］具有一定的療效。穿心蓮提取液的初步純化工藝多采用大孔吸附樹脂法，如范去鴿等［6］用ADS-7樹脂對傳統的乙醇回流提取液進行純化，分離干燥后得到的浸膏中含穿心蓮內酯25.3%;吳嬌等［7］采用DA201樹脂吸附，分離干燥后得到的浸膏中穿心蓮內酯量達47%。由于穿心蓮葉子中葉綠素含量較高，傳統的乙醇回流法制得提取液中色素量高，上柱前還需經濃縮處理。經濃縮后的上柱液較渾濁，致使大孔吸附樹脂易被色素堵塞、污染，使其分離效果降低，再生周期縮短。

減壓內部沸騰法［8-9］是一種低溫快速提取方法，本實驗對采用該法制得的穿心蓮提取液進行了大孔吸附樹脂吸附純化研究，并與回流提取液［10］純化進行比較，為含有高葉綠素中藥的分離純化提供技術參考。

1 實驗材料和方法

1.1 材料穿心蓮(南寧藥材市場，產地廣西);穿心蓮內酯對照品(98%，中國藥品生物制品檢定所);甲醇(一級色譜純，天津四友化學藥劑有限公司);乙醇(分析純，廣東汕頭市西隴化工廠);大孔樹脂HPD-100、AB-8、X-5、D-4020、NKA-9和D-101(南開大學化工廠)。

1.2 儀器CBM-10A vp型高效液相色譜儀(日本島津公司);SHB-ⅢT型循環水式多用真空泵(鄭州長城科工貿有限公司);HZS-H型恒溫振蕩水槽(上海市實驗儀器總廠);RE-52AA型旋轉蒸發儀(上海亞榮生化儀器廠);DHL-A型電腦恒流泵(上海青浦滬西儀器廠);PC2501紫外分光光度計(日本島津公司)。

1.3 方法

1.3.1 提取液制備

1.3.1.1 減壓內部沸騰法稱取10.0 g穿心蓮粉末，用10 mL 80%乙醇溶液均勻潤濕30 min，使乙醇溶液充分滲透物料;加入12倍量溫度為59℃的32%乙醇溶液，迅速減壓至表壓為－0.074 MPa，提取4 min后，卸壓，過濾，得到穿心蓮內酯質量濃度為1.95 mg/mL的提取液，備用。

1.3.1.2 乙醇回流法稱取10.0 g穿心蓮粉末，于500 mL圓底燒瓶中，用85%乙醇回流提取2次，每次2 h，第一次10倍量，第二次8倍量，過濾，合并濾液，減壓回收乙醇，濃縮液加入95%的乙醇溶液，配制成含乙醇量為32%的上柱液，備用。

1.3.2 大孔吸附樹脂純化

1.3.2.1 樹脂的篩選分別稱取預處理過的HPD-100、AB-8、X-5、D-4020、NKA-9和D-101樹脂0.50 g置于具塞磨口三角瓶中，加入減壓內部沸騰法制得的提取液50 mL，25℃恒溫振蕩24 h，測定吸附后剩余液中穿心蓮內酯的濃度。將達吸附平衡的樹脂過濾取出，再用50 mL 75%乙醇，在25℃恒溫振蕩24 h進行解吸，測定解吸液中穿心蓮內酯的濃度，計算平衡吸附量和解吸率，確定被采用的樹脂。

1.3.2.2 吸附工藝條件的確定稱取10.0 g預處理過的HPD-100樹脂裝入層析柱(10 mm×300 mm，柱床體積為20 mL)中，將350 mL提取液以一定的流速通入柱中，分部收集流出液，測定各部分流出液中穿心蓮內酯的濃度，作樹脂的泄露曲線，考察上樣流速對樹脂動態吸附性能的影響。

1.3.2.3 洗脫工藝條件的確定樹脂吸附完成后，用150 mL一定濃度的乙醇水溶液以一定的流速進行洗脫，考察含乙醇量、體積流量對洗脫效果的影響，確定最佳洗脫劑濃度并繪制洗脫曲線。

1.3.3 分析方法

1.3.3.1 穿心蓮內酯的測定［11］采用高效液相色譜法，色譜條件為Wondersil C18(5 μm，150 mm×4.6 mm)色譜柱，體積流量1.0 mL/min;流動相為甲醇-水(52∶48，V/V)，檢測波長225 nm;進樣量20 μL;室溫。

1.3.3.2 標準曲線的繪制精確稱取真空干燥后的標準品穿心蓮內酯6.5 mg，用甲醇溶解，待完全溶解后轉移至25 mL量瓶中，用甲醇定容至刻度，制得0.028 9 mg/mL的標準溶液。精密吸取2、4、6、8、10 μL，按以上色譜條件測定峰面積，進樣量X與峰面積Y的回歸方程為Y=544 820X+507 9.3(R2=0.999 9)。

1.3.3.3 色素的相對含有量測定［12］采用紫外可見分光光度法，將提取液和泄漏液配制成單位提取物相同量，在波長為670 nm下測定吸光度，樹脂殘留色素量A=A提取液－A泄露液。

2 實驗結果與討論

2.1 樹脂的篩選表1為6種大孔樹脂的物理性質及其對穿心蓮內酯的平衡吸附量和解吸率的測定結果。

表1 樹脂的物理性質及其平衡吸附量和解吸率

由表1可以看出，吸附量順序為HPD-100＞D-101＞AB-8＞X-5＞D-4020＞NKA-9，而解吸率順序為D-101＞HPD-100＞AB-8＞D-4020＞X-5＞NKA-9。穿心蓮內酯極性較小，一般是選用弱極性或非極性的樹脂。HPD-100樹脂的比表面最大，其吸附量最大，雖然其孔徑最小，但由于穿心蓮內酯分子體積并不很大，對解吸的影響不大，因而選擇HPD-100較為理想。

2.2 吸附工藝條件的確定不同上樣體積流量，HPD-100樹脂對內部沸騰提取液的動態吸附性能如圖1所示。

圖1 不同體積流量下HPD-100樹脂吸附穿心蓮內酯的泄露曲線

由圖1知，泄露穿心蓮內酯量達到總量(C/C0)的0.05時，上柱體積流量為0.5、1、2 mL/min對應的上柱液體積分別為175、150、75 mL。從吸附效果考慮，低速操作有利，但在實際應用中，必須考慮單位時間的處理能力。比較可知，體積流量為0.5 mL/min的吸附效果比1 mL/min好，但處理量增加的幅度不大。因此，上柱體積流量以1 mL/min為宜，上柱體積為150 mL。

2.3 洗脫工藝條件的確定對上柱體積流量以1 mL/min吸附的柱，依次采用15%～55%乙醇溶液對穿心蓮內酯進行梯度洗脫(見圖2)。

圖2 不同體積分數乙醇梯度洗脫所得穿心蓮內酯的純度和得率

由圖2可以看出，15%、25%的乙醇水溶液對穿心蓮內酯的洗脫能力較差，洗脫液中穿心蓮內酯的量很少。當含乙醇量增至35%時，隨著含乙醇量的升高，洗脫液中穿心蓮內酯的量逐漸增大，以45%乙醇洗脫液中穿心蓮內酯的量和收率最高，隨后，再用55%的乙醇溶液進行洗脫，洗脫液中穿心蓮內酯的含量較少，表明采用45%的乙醇洗脫液便可將大部分的穿心蓮內酯解吸。因此，選用45%的乙醇作為洗脫劑。

對吸附后的HPD-100樹脂床，以25%乙醇水溶液洗去與樹脂吸附弱的強極性雜質后，采用45%乙醇分別以1 mL/min、0.5 mL/min的體積流量進行洗脫，洗脫曲線如圖3所示。

圖3 不同體積流量下45%乙醇溶液的洗脫曲線

由圖3可以看出，以0.5 mL/min的洗脫效果最佳，洗脫峰較集中，拖尾現象不是很明顯。這可能是體積流量對洗脫劑與吸附在樹脂上的穿心蓮內酯間的交換速率進行影響所致，體積流量太快，洗脫劑未能與被吸附的內酯充分作用而將其從大孔樹脂的吸附位點上置換出來。當洗脫體積流量為0.5 mL/min，洗脫液達100 mL時，穿心蓮內酯基本洗脫完全。

2.4 乙醇回流提取液與減壓內部沸騰提取液純化效果的比較在相同的吸附和解吸條件下，將乙醇回流提取液進行上柱，并與減壓內部沸騰法進行比較，兩者純化效果見表2。

表2 乙醇回流提取液與減壓內部沸騰提取液純化效果的比較

由表2可以看出，采用大孔樹脂選擇性吸附，大大提高了穿心蓮內酯的純度。其中，減壓內部沸騰法制得的提取液經純化后，穿心蓮內酯的含有量達72.70%，比醇提法高出15.46%，回收率達82.89%，也略高于醇提法，其主要原因是回流提取液的色素量比內部沸騰提取液高1.55倍，且樹脂吸附后殘留色素也高14.7倍，對樹脂的吸附及洗脫生產了很大影響。

2.5 同一批樹脂連續分離效果的比較對每一批提取液分離后的層析柱采用95%乙醇進行簡單再生，然后按上述確定的吸附洗脫條件，分別取乙醇回流法和減壓內部沸騰法的提取液過柱分離，重復操作4次，其結果見表3。

由表3可以看出，樹脂重復使用后，穿心蓮內酯的純度均有所下降，以乙醇回流法的下降速度更快，且樹脂殘留的色素量增加。其中，傳統醇提液上柱的樹脂重復使用3次后，穿心蓮內酯的純度降為50%以下，而減壓內部沸騰提取液上柱的樹脂重復使用4次后，內酯的純度仍在50%以上，對要求控制產品純度大于50%的工藝，采用減壓內部沸騰提取液樹脂可以重復使用4次，而采用乙醇回流提取只能使用2次。

表3 乙醇回流提取液與減壓內部沸騰提取液樹脂再生效果的比較

3 討論

3.1 通過靜態吸附與解吸實驗的運用，篩選到適用于穿心蓮內酯分離純化用的大孔吸附樹脂為HPD-100，并確定了樹脂床體積為60 BV，最佳的純化工藝條件:上柱液體積流量為1 mL/min，上樣量為150 mL，洗脫劑質量分數為45%，洗脫體積流量為0.5 mL/min，洗脫劑用量為100 mL。在此條件下，精制后的穿心蓮內酯的純度從初始的11.16%提高到72.70%，比醇提高出15.46%，回收率達82.89%，也略高于醇提，且樹脂殘留色素較少，樹脂重復次數比醇提法提高一倍。

3.2 采用減壓內部沸騰法制得的穿心蓮提取液，能有效降低葉綠素等雜質的溶出，減少了對后續大孔吸附樹脂純化工藝的干擾。減壓內部沸騰法提取-大孔樹脂吸附的新工藝提高了產品質量，延長了樹脂的使用壽命，值得推廣。

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