人臍帶間充質干細胞于不同通電情況下在聚吡咯上生長情況的形態

張 涵，吳 昭，黃 華，孫曉丹，安沂華

（1.首都醫科大學北京市神經外科研究所，北京 100050；2.清華大學材料科學與工程系，北京 100086）

神經系統作為生物體內電活動最為活躍的部分之一，電磁場作用對其有著特別重要的意義（1），成為神經系統損傷修復的研究熱點之一。聚吡咯（PPy）是近年來新興的具有較好組織相容性的導電材料。臍帶間充質干細胞（human umbilical cord mesenchymal stem cell，hUC-MSC）是近年來間充質干細胞研究中的熱點，是未來干細胞應用中的重要成員。然而，將hUC-MSC與PPy共培養，對不同條件的電刺激對細胞形態和貼附的影響的研究還十分少見。本實驗將hUC-MSC與PPy共培養，對細胞在不同通電情況下的形態學變化進行研究，對闡明由PPy介導的直接電刺激對hUC-MSC的影響提供初步依據。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

PPy由清華大學材料系提供

試劑：αMEM（Hyclon公司），胎牛血清（Hyclon公司），無色低糖DMEM（Gibco公司），4％多聚甲醛（Sigma公司），0.25％胰酶（含0.02％EDTA） （Sigma公司）；細胞流式檢測抗體（均為小鼠IgGl抗體）：PE-CD29單克隆抗體，FITC-CD44單克隆抗體，PE-CD54單克隆抗體，PE-CD 45單克隆抗體，FITC-CD 106單克隆抗體，FITC-CD14單克隆抗體，PE-CD34單克隆抗體，FITC-HLA-DR單克隆抗體（美國BD BDIS公司）；

主要儀器：電極：銅鍍鋅電極；掃描電鏡（HITACHI TM-1000）；FACSCalibur流式細胞儀及CellQuest軟件（Becton Dickinson）

1.2 hUC-MSC分離培養與鑒定

選擇健康的正常孕周的剖腹產產婦，經其同意后，于手術后取臍帶約5～10 cm，無菌條件下去除其表面羊膜及臍帶內血管，取Wharton’s Jelly，于生理鹽水中清洗3次后，剪成體積約1 cm3的小塊，置于含10％胎牛血清的αMEM培養基中采用貼壁法進行培養，每5～7 d進行傳代。收集第3～6代的細胞，利用倒置相差顯微鏡和流式細胞儀進行鑒定。

1.3 PPy制備

選用對甲基苯磺酸鈉（TsONa）為支持電解質，加入對甲基苯磺酸（TsOH）為添加劑，采用三電極電化學體系制備PPy薄膜。

1.4 hUC-MSC與PPy共培養及通電刺激

選擇第 3～6代的hUC-MSC，制備成濃度為0.25×106/m L的細胞懸液，接種于面積為4 cm2的PPy表面，加入培養基5 m L，置于5％CO2、37℃環境內共培養24 h，換入無血清無色低糖DMEM作為通電時的培養基后進行通電刺激，通電后換回原含血清αMEM培養基。

1.5 實驗分組

（1）對照組：將hUC-MSC置于蓋玻片上，在含有10％胎牛血清的αMEM培養基中培養3 d

（2）不加電組：將hUC-MSC于PPy共培養3 d

（3）控制電壓組：將hUC-MSC于PPy共培養24 h后，施加電刺激，將場強控制為100 mV/mm，由于PPy上兩電極間距離為3.5 cm，因此控制電壓V= 3.5V，通電時間t=1 h/d，連續通電3 d。

（4）控制電流組：將hUC-MSC于PPy共培養24 h后，施加電刺激，將電流控制為I=10mA，通電時間t=1 h/d，連續通電3 d。

1.6 hUC-MSC單獨或與PPy共培養后SEM檢測

hUC-MSC單獨或與PPy共培養并通電3 d后，室溫下置于4％多聚甲醛中固定4 h，生理鹽水沖洗，掃描電鏡觀察細胞在PPy表面貼附情況及細胞形態變化。

1.7 hUC-MSC與PPy共培養4d后，收集其培養基，光鏡下觀察是否仍有細胞懸浮。

2 結果

2.1 hUC-MSC鑒定

光鏡下顯示第3～6代時，單個細胞多呈梭形類似于成纖維細胞形態，折光性良好，細胞生長密度增加趨于融合時，呈現平行排列或典型魚群樣生長，均一性良好。采用流式細胞儀對第3～6代細胞進行檢測發現其不表達造血干細胞標記CD34、CD45、CD14、CD106和HLA-DR，而MSCs黏附分子和基質細胞標記CD44、CD29、CD54均呈高表達（數據未顯示）。

2.2 hUC-MSC單獨或與PPy共培養后SEM觀察

2.2.1 對照組

hUC-MSC單獨培養，電鏡下可見hUC-MSC在蓋玻片上貼附，細胞呈魚群樣或平行樣排列，絕大部分呈梭形，形態飽滿，邊緣清晰，部分細胞伸出細長偽足。（彩插2圖1）

2.2.1 不加電組

電鏡下可見hUC-MSC在PPy表面貼附，主要聚集貼附于局部地區，其他地區基本未見有細胞分布。細胞基本呈長梭形，形態飽滿，邊緣較為清晰，可見細胞伸出細長偽足，細胞在密度較大的區域呈現平行排列生長。（彩插2圖2）

2.2.2 控制電壓組

電鏡下可見hUC-MSC在PPy表面貼附，主要聚集貼附于局部地區，其他地區也有分布。細胞基本呈扁平狀，細胞間的分界不清，常匯合成片，在PPy表面突起較為明顯時，細胞可伸展為扁平薄片狀，部分細胞表面出現破損（彩插2圖3）。

2.2.3 控制電流組

電鏡下可見hUC-MSC在PPy表面貼附，總體較為均勻，在部分地區更為密集，其他地區稍少。細胞基本呈扁平狀，細胞間常匯合成片、分界不清。在細胞密度較大時局部有重疊增厚現象（彩插2圖4）。

2.3 光鏡下觀察hUC-MSC與PPy共培養4d后培養基

光鏡下可見3個實驗組培養基中均有較多量細胞懸浮。將懸浮細胞離心后重新接種于培養瓶中，3～5 d后仍可出現典型梭形細胞呈魚群樣生長。

3 討論

神經系統的電活動活躍，電刺激對其損傷修復具有明顯的影響。如何利用這個特性對神經損傷進行修復是近年來相關研究的方向之一。

hUC-MSC是近年來干細胞研究中的熱點，具有干細胞的基本特性即自我更新能力及多向分化潛能，目前認為，hUC-MSC可能通過“替代作用”和/或“營養作用”促進神經系統損傷修復，雖然其修復機制尚未明確，但已有多項研究證明這種修復作用是十分顯著的［2-4］。而且其分離提取不對產婦和新生兒造成額外損傷，并規避了有關的醫學倫理問題，體外培養方法較為簡便，因此成為未來干細胞臨床應用的重點研究對象之一。聚吡咯本身即具有導電性能，容易制備，表面特性易于改變，且具有良好的組織相容性［5-7］，可顯著降低星形膠質細胞的黏附、聚集，減少膠質瘢痕的形成［8］，并可在外源性電場影響下促進粘附其上的神經細胞的軸突有方向性地延伸［9］。本研究針對神經組織的特點，采用聚吡咯作為支架，與hUC-MSC共培養，對體外條件下不同通電情況對細胞的影響進行初步研究，可為將來將兩者結合修復中樞神經系統損傷提供初步依據。

研究結果顯示，電刺激對細胞形態學的影響主要體現在以下幾個方面：

（1）PPy表面細胞分布

hUC-MSC可在通電和不通電的情況下貼附于PPy表面，但貼附情況不盡相同。從對照組結果可見，普通培養條件下，在貼附條件適合的情況下，大部分細胞可均勻貼附于介質表面。當細胞培養于PPy表面且不通電時，大部分細胞集中于部分地區，其他地方細胞較少。相比之下，通電時貼附分布地相對均勻，控制電流時此種現象更為明顯，提示電刺激可能促進細胞在局部遷移，但這改變很有限。同時，在兩種不同方式的通電實驗組中，均未發現細胞在PPy支架的正負極的分布有明顯區別。

（2）細胞形態

實驗結果顯示，電刺激對貼附于PPy上的hUCMSC形態影響顯著。對照組中，細胞保持梭形，形態飽滿，分界清晰，細胞匯合少見。培養于PPy表面無電刺激時，hUC-MSC基本保持梭形，細胞間分界清楚，呈平行排列或典型魚群樣生長；施加電刺激后，細胞主要呈扁平薄皮狀，細胞間常匯合成片、分界不清。不同形式的電刺激對細胞形態影響的比較類似。

產生上述現象的原因可能包括：

（1）細胞形態改變的主要是由于細胞骨架的重組和細胞膜-骨架聯系的解體。據報道，外加電刺激可以引起細胞骨架重排［10］，對細胞形狀及變形產生重要影響，從而可能使細胞的外觀產生顯著變化，也對細胞的遷移產生了一定的促進。

（2）外加電刺激可能導致細胞膜彈性有一定程度的增加，因而進一步影響了細胞的運動以及細胞—細胞間作用［11］。

（3）對hUC-MSC來說，細胞膜與細胞骨架之間的聯系相對分化成熟細胞較為松弛［12］，從而導致其對外界刺激更加敏感，對外界的反應也更加顯著。

（4）hUC-MSC與PPy共培養數天后仍有較多細胞未貼附，說明PPy雖然具有較好的組織相容性，但其表面性質仍然較不適宜hUC-MSC，故這也是今后的工作中需要進一步改進的。同時也不排除因為外加電刺激對細胞產生影響，減低了hUC-MSC的貼附性。

此外，處于電場中和直接與導電材料接觸對細胞的影響有著顯著的不同。實驗中所選擇的外加電刺激強度主要依據以往文獻報道的數據。其中場強100mV/mm及以上在研究電場對細胞作用時較為常用［13-14］；電流I=10mA及以上在研究導電流對細胞作用時較為常用［15］。通過實驗結果可以看出，將適用于電場的數據直接套用于導電材料實驗，對于細胞的破壞性可能更大。

綜上所述，利用生理性電磁場或者外加電磁場對神經系統損傷修復是未來研究方向之一，聚吡咯與hUC-MSC相結合在這個方面具有很強的可操作性，但是現階段仍然面臨很多問題，需要進一步的實驗研究加以解決。

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