苦豆籽中抑菌活性物質(zhì)的跟蹤篩選研究

史高峰，張 梅，陳學(xué)福，王國英，陳英贊

(蘭州理工大學(xué)石油化工學(xué)院，甘肅蘭州730050)

苦豆子(Sophora alopecuroides)是豆科槐屬野生草本植物，廣泛分布于我國西北的甘肅、寧夏、新疆等地，具有清熱解毒、祛風(fēng)燥濕、平喘止咳、止痛殺蟲等作用［1－2］。現(xiàn)代藥理研究表明，苦豆子生物堿具有抗腫瘤、抗病毒、抗炎、抗菌等藥理活性［3－5］，尤其是在殺蟲抑菌方面，具有很好的生物活性，已在農(nóng)業(yè)上獲得了廣泛的應(yīng)用。本文旨在篩選苦豆籽中有效成分的抑菌活性，對其抑菌作用進(jìn)行系統(tǒng)的研究，并通過跟蹤分離篩選出苦豆籽中最佳抑菌物質(zhì)，為其在農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥和日用化學(xué)等行業(yè)中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 實(shí)驗(yàn)藥物

苦豆籽(苦豆子的成熟種子)，產(chǎn)于寧夏鹽池，粉碎，過60目篩保存待用。苦參堿、氧化苦參堿(本實(shí)驗(yàn)室自制，純度＞90%);氧化苦參堿和氧化萊曼堿的混合物。

1.1.2 菌株

金黃色葡萄球菌(ATCC25923)、大腸桿菌(C83)、綠膿桿菌(10104)、白色念珠菌(10231)由蘭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)教研室提供。

1.1.3 培養(yǎng)基

水解酪蛋白瓊脂、慶大霉素紙片(杭州微生物試劑廠);牛肉膏，蛋白胨、NaCl(杭州微生物試劑廠);蒸餾水等。

1.1.4 實(shí)驗(yàn)儀器

JH－DCB超凈工作臺、YLD－6000SHP恒溫生化培養(yǎng)箱(揚(yáng)州鴻都電子有限公司);RE－3000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠);SHZ－DⅢ循環(huán)水式多用真空泵(鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司);YX280A手提式不銹鋼蒸氣消毒器(上海三申醫(yī)療器械有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 藥品的制備

1.2.1.1 粗提物藥液的制備 準(zhǔn)確稱取100 g粉碎的苦豆籽，置于1000 mL的圓底燒瓶中，采用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為60%的乙醇溶液進(jìn)行熱回流提取，固液比為1∶6，提取時(shí)間為2 h，共提4次，過濾，合并濾液并減壓濃縮，所得濃縮液取少量制成浸膏備用，剩余的濃縮液依次用石油醚、氯仿、正丁醇進(jìn)行萃取，每種溶劑萃取至無色為止，所得萃取液分別濃縮，制得浸膏備用。

取60%乙醇浸膏、石油醚浸膏、氯仿浸膏、正丁醇浸膏溶于二甲基亞砜中，配制成濃度為300 mg/mL的藥液，備用。

1.2.1.2 單體類藥液的制備 取本實(shí)驗(yàn)室自制的苦參堿單體，氧化苦參堿單體及氧化苦參堿和氧化萊曼堿的混合物溶于無菌水中，配制成20 mg/mL的藥液，備用。

1.2.2 菌液的制備

取實(shí)驗(yàn)菌種接種于MH瓊脂平板培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)20 h，用MH液體培養(yǎng)基制備菌懸液，菌液濃度為0.5麥?zhǔn)蠁挝?108cfu/mL)備用，5℃冰箱保存(不超過 12 h)［6］。

1.2.3 含藥紙片的制備

將吸水性強(qiáng)的濾紙用打孔器打成直徑為6 mm的圓形小紙片，分裝于潔凈干燥的小培養(yǎng)皿中，經(jīng)121℃高壓滅菌20～25 min后，取出，放入干燥箱內(nèi)進(jìn)行干燥，備用。每張濾紙片分別加藥液各10 μL，空白對照組加無菌蒸餾水10 μL，陰性對照組加分析純 DMSO 10 μL，陽性對照組加慶大霉素 10 μL［7］。

1.2.4 菌落記數(shù)

將實(shí)驗(yàn)的菌液稀釋 10－5和10－6倍接種于 MH瓊脂平板培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)20 h，記數(shù)瓊脂平板培養(yǎng)基菌株的個(gè)數(shù)。

1.2.5 最低抑菌濃度(MIC)的測定

將實(shí)驗(yàn)所用各種藥液用適量的溶劑(DMSO)進(jìn)行二倍稀釋后，每張紙片分別加已稀釋成不同濃度的藥液10 μL，空白對照組加無菌蒸餾水10 μL，陰性對照組加分析純DMSO 10 μL，置37℃恒溫生化培養(yǎng)箱20 h，完全沒有抑菌直徑的最低濃度為該物質(zhì)的最低抑菌濃度(MIC)。

1.2.6 K －B 實(shí)驗(yàn)法

取濃度為108cfu/mL的菌液100 μL，均勻涂布整塊MH瓊脂培養(yǎng)基表面，室溫3～5 min后，貼加含藥紙片，置入37℃恒溫生化培養(yǎng)箱20 h，觀察菌落生長情況，測定紙片周圍抑菌圈直徑大小，各稀釋液的每項(xiàng)抑菌實(shí)驗(yàn)平行重復(fù)3次。

2 結(jié)果與討論

2.1 苦豆籽粗提物的抑菌作用

取300 mg/mL的60%乙醇浸膏(A)、石油醚浸膏(B)、氯仿浸膏(C)、正丁醇浸膏(D)按照1.2.6方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。其對大腸桿菌、綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌和白色念珠菌的抑菌實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)見表1。

表1 苦豆籽粗提物對大腸桿菌、綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌和白色念珠菌的抑菌作用

由表1可知，苦豆籽粗提物對實(shí)驗(yàn)所用菌種都有不同程度的抑制作用。對大腸桿菌的抑制作用為:C﹥D﹥A﹥B，即氯仿浸膏﹥正丁醇浸膏﹥60%乙醇浸膏﹥石油醚浸膏;對綠膿桿菌的抑制作用由大到小依次為:60%乙醇浸膏﹥氯仿浸膏﹥正丁醇浸膏﹥石油醚浸膏;對金黃色葡萄球菌的抑制作用由大到小依次為:氯仿浸膏﹥60%乙醇浸膏﹥正丁醇浸膏，石油醚浸膏的抑菌圈直徑很小，無法測量，其抑菌作用非常微弱;對白色念珠菌的抑制作用由大到小依次為:氯仿浸膏﹥60%乙醇浸膏﹥正丁醇浸膏，石油醚浸膏抑菌作用微弱。

由上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知:氯仿浸膏的抑菌作用是較強(qiáng)且廣的，可能是因?yàn)槁确陆嘀泻罅可飰A，因此具有強(qiáng)抑菌作用。而石油醚浸膏中主要為低極性的脂溶性成分，因此抑菌作用較弱。

2.2 苦豆籽單體類化合物的抑菌作用

取20 mg/mL的苦參堿單體(E)，氧化苦參堿單體(F)及氧化苦參堿和氧化萊曼堿的混合物(G)按照1.2.6方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。其對大腸桿菌、綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌和白色念珠菌的抑菌實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)見表2。

表2 苦豆籽單體對大腸桿菌、綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌和白色念珠菌的抑菌作用

由表2可知:苦豆籽單體類化合物對實(shí)驗(yàn)所用菌種都具有較強(qiáng)的抑制作用。對大腸桿菌的抑制作用:E﹥F﹥G，即苦參堿﹥氧化苦參堿﹥氧化苦參堿和氧化萊曼堿的混合物;對綠膿桿菌的抑制作用由大到小依次為:苦參堿和氧化苦參堿抑菌作用基本相當(dāng)﹥氧化苦參堿和氧化萊曼堿的混合物;對金黃色葡萄球菌的抑制作用由大到小依次為:苦參堿﹥氧化苦參堿﹥氧化苦參堿和氧化萊曼堿的混合物;對白色念珠菌的抑制作用由大到小依次為:苦參堿﹥氧化苦參堿和氧化萊曼堿的混合物﹥氧化苦參堿。

由上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，苦參堿的抑菌作用是最強(qiáng)的，其次是氧化苦參堿，且對細(xì)菌的抑制作用要比真菌稍強(qiáng)，但對綠膿桿菌的抑制作用較弱。氧化萊曼堿對白色念珠菌的抑制作用較好，可進(jìn)一步分離得到單體，進(jìn)行藥理活性研究。

2.3 苦參堿和氧化苦參堿的最低抑菌濃度(MIC)的測定

取5.0 mg/mL的苦參堿溶液和氧化苦參堿溶液作為原樣液，采用二倍稀釋方法按照1.2.6方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。其對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、綠膿桿菌和白色念珠菌的最低抑菌濃度(MIC)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)見表3、表4。

由表3可知，最低抑菌濃度表明:V苦參堿對大腸桿菌的抑菌能力大于綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌和白色念珠菌。對大腸桿菌的最低抑菌濃度為19.55 μg/mL，對綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌和白色念珠菌的最低抑菌濃度為39.1 μg/mL。

表3 苦參堿對大腸桿菌、綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌和白色念珠菌的影響(MIC)

表4 氧化苦參堿對大腸桿菌、綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌和白色念珠菌的影響(MIC)

由表4可知，最低抑菌濃度表明:氧化苦參堿對大腸桿菌的抑菌能力大于綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌，對白色念珠菌抑菌能力最弱。對大腸桿菌的最低抑菌濃度為39.1 μg/mL，對綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌和白色念珠菌的最低抑菌濃度為78.2 μg/mL。

3 結(jié)論

本文通過對苦豆籽的不同極性部位藥用成分及單體類化合物進(jìn)行活性物質(zhì)的跟蹤抑菌實(shí)驗(yàn)，為進(jìn)一步篩選天然抑菌劑的研究奠定了良好的基礎(chǔ)，并得出以下結(jié)論:

苦豆籽不同極性溶劑萃取物對大腸桿菌、綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌和白色念珠菌都有不同程度的抑制作用，其中氯仿浸膏的抑制作用較強(qiáng)，石油醚浸膏的抑制作用最弱;從苦豆籽中自制的苦參堿、氧化苦參堿以及氧化苦參堿和氧化萊曼堿的混合物對實(shí)驗(yàn)所用菌種也都有較強(qiáng)的抑制作用，其中苦參堿的抑制作用最強(qiáng)，并測定了苦參堿和氧化苦參堿對4種菌種的最低抑菌濃度(MIC)。可知苦豆籽中主要抑菌成分為生物堿類化合物，其中苦參堿的抑菌效果優(yōu)于氧化苦參堿，因其獨(dú)特的結(jié)構(gòu)特征及化學(xué)性質(zhì)廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥等行業(yè)，加強(qiáng)其活性研究具有重大的社會意義和經(jīng)濟(jì)效益，并為篩選有效的天然抑菌物質(zhì)提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

［1］ 劉軍鋒，丁澤，歐陽艷，等.苦豆子生物堿抗茵活性的測定［J］.北京化工大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版，2011，38(2):84－88.

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［3］ 牟新利，王武寶，巴杭，等.中藥苦豆子化學(xué)成分及生理活性的研究進(jìn)展［J］.新疆師范大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版，2005，24(1):45－50.

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