天可力氨糖膠囊中氨基葡萄糖硫酸鉀測定方法比較

吳素玲，張衛(wèi)明，孫曉明，張鋒倫，許國寧

(南京野生植物綜合利用研究院，江蘇南京210042)

本實(shí)驗(yàn)參照GB/T 20365－2006采用液相色譜法［1］及應(yīng)用 Fdson—Morgan反應(yīng)原理采用比色法［2－6］對(duì)天可力氨糖膠囊中氨基葡萄糖硫酸鉀含量進(jìn)行測定比較，建立了天可力氨糖膠囊中氨基葡萄糖硫酸鉀含量的測定方法。

1 液相法測定氨基葡萄糖含量

1.1 材 料

1.1.1 材料及試劑 氨基葡萄糖鹽酸鹽標(biāo)準(zhǔn)品:中國藥品生物制品檢定所;

天可力氨糖膠囊:自制，主要成分為:氨基葡萄硫酸鉀∶中藥A和中藥B=55∶45(m/m);

氨基葡萄糖硫酸鉀鹽:由揚(yáng)州日興生物化工制品有限公司提供，為白色結(jié)晶粉，純度≥99%;

植物提取物A和植物提取物B:由宣城伊康天然產(chǎn)物科技開發(fā)責(zé)任有限公司提供;

戊烷磺酸鈉:江蘇省疾控中心提供，分析純;

HPLC分析用乙腈:色譜純，美國TEDIA;

HPLC分析用水:為娃哈哈純凈水;

戊烷磺酸鈉溶液:稱取0.174 g戊烷磺酸鈉，用純凈水溶解，移至100 mL容量瓶中，定容，溶液濃度為10 mmol/L。

1.1.2 主要儀器設(shè)備 電子天平EL－410s:美國Setra;KQ－600E型數(shù)控超聲波清洗器:昆山市超聲儀器有限公司;Agilent 1200高效液相色譜儀:安捷倫科技有限公司;色譜柱:Zorbax C18(5 μm，150 mm×4.6 mm)，安捷倫科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 稱取氨基葡萄糖鹽酸鹽標(biāo)準(zhǔn)品13.8 mg，加入2.5 mL乙腈，振蕩使其分散均勻，再加入純凈水，超聲溶解，定容至25 mL，搖勻，備用。濃度為:0.552 mg/mL。

1.2.2 樣品待測液的制備 (1)氨基葡萄糖硫酸鉀鹽溶液:稱取樣品35.0 mg，加入2.5 mL乙腈，振蕩使其分散均勻，再加入水，超聲溶解，定容至50 mL，搖勻，備用。HPLC測定前，用0.2 μm 濾膜過濾。(2)植物提取物A溶液:稱取樣品51.6 mg，后面操作同(1)。(3)植物提取物B溶液:稱取樣品49.9 mg，后面操作同(1)。(4)天可力氨糖膠囊溶液:稱取膠囊內(nèi)容物129.6 mg，加入5.0 mL乙腈，振蕩使其分散均勻，再加入水，超聲溶解，定容至100 mL，搖勻，備用。HPLC測定前，用0.2μm濾膜過濾。

1.2.3 HPLC的色譜條件 HPLC的色譜條件是:Agilent 1200，四元泵;Eclipse XDB － C18，分離柱(4.6 mm ×15 mm，5 μm);柱溫25 ℃;DAD 檢測器;流動(dòng)相:乙腈:戊烷磺酸鈉水溶液(10 mmol/L。0.87 g戊烷磺酸鈉溶解于500 mL水中)=1∶9;流速:0.5 mL/min;進(jìn)樣量:10 uL。檢測波長:192 nm。

1.2.4 HPLC的色譜測定 分別將標(biāo)準(zhǔn)液、各樣品液注入液相色譜儀以上述色譜條件進(jìn)行色譜測定，記錄其峰面積，對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)液濃度進(jìn)行計(jì)算。

1.2.5 計(jì) 算 (1)樣品氨基葡萄糖含量按照以下公式計(jì)算:

式中，W1:樣品中氨基葡萄糖含量，%;Ai:樣品溶液中被測物峰面積;Mis:標(biāo)準(zhǔn)溶液中被測物標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)量，mg;Ais:標(biāo)準(zhǔn)溶液被測物標(biāo)準(zhǔn)品的色譜峰面積;m:樣品的質(zhì)量，mg;0.83:氨基葡萄糖(179)與鹽酸氨基葡萄糖(216.35)的相對(duì)分子質(zhì)量比。

(2)樣品氨基葡萄糖硫酸鉀鹽含量=樣品中氨基葡萄糖含量÷0.6

式中0.6為:氨基葡萄糖(179)與氨基葡萄糖硫酸鉀鹽(297.32)的相對(duì)分子質(zhì)量比。

1.3 結(jié) 果

通過HPLC測定，各圖譜結(jié)果如下圖1、圖2、圖3、圖 4、圖 5。記錄其峰面積，對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)液濃度按上述公式進(jìn)行計(jì)算得結(jié)果為下表1。

圖1 氨基葡萄糖鹽酸鹽圖譜

圖2 氨基葡萄糖硫酸鉀圖譜

圖3 植物提取物A圖譜

圖4 植物提取物B圖譜

圖5 天可力氨糖膠囊內(nèi)容物圖譜

表1 含量分析結(jié)果

圖6 對(duì)比圖

1.4 結(jié)果分析

把圖1、圖2、圖3、圖4的圖譜進(jìn)行對(duì)比得到如下 圖6。

從各HPLC圖譜及上面的對(duì)比圖都能清楚看出氨基葡萄糖鹽酸鹽、氨基葡萄糖硫酸鉀鹽、植物提取物A、植物提取物B在該色譜條件下，2.84 min均有明顯的色譜峰，也就是說通過這個(gè)方法植物提取物A和植物提取物B中都能測得氨基葡萄糖含量。并且從結(jié)果數(shù)據(jù)看如果折成氨基葡萄糖硫酸鉀則含量達(dá)到49.80%和28.88%，這對(duì)天可力氨糖膠囊中實(shí)際添加的氨基葡萄糖硫酸鉀測定有相當(dāng)大的干擾作用。

天可力氨糖膠囊配方中氨基葡萄糖硫酸鉀含量為55%，但從表1中可見測得得到的含量值為88.97%，這個(gè)測得方法導(dǎo)致測得氨基葡萄糖硫酸鉀含量為實(shí)際含量的162%。

這個(gè)方法對(duì)添加有植物提取物等成分比較復(fù)雜的混合物中的氨基葡萄糖的含量是很不可靠的。

2 比色法測定氨基葡萄糖含量

2.1 材 料

2.1.1 材料及試劑 氨基葡萄糖鹽酸鹽標(biāo)準(zhǔn)品、天可力氨糖膠囊、氨基葡萄糖硫酸鉀鹽、植物提取物A和植物提取物B:見1章;

鹽酸、無水乙醇、碳酸鈉、乙酰丙酮、對(duì)二甲氨基苯甲醛:市售，為分析純;

Na2CO3試液:精確取其5.3 g碳酸鈉，溶于蒸餾水中，定溶至100 mL.濃度為0.5 mol/L;

乙酰丙酮試液:取2 mL乙酰丙酮溶液，加碳酸鈉溶液溶解，定溶至100 mL。(過夜后用)含量為2%;

對(duì)二甲氨基苯甲醛酸醇溶液:精確取其0.6 g，分別加入10mL無水乙醇和10 mL濃鹽酸配制而成。含量為3%。

2.1.2 主要儀器設(shè)備 電子天平EL－410s、KQ－600E型數(shù)控超聲波清洗器:見1節(jié);TU－1800紫外可見分光光度計(jì):北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器RE－52AA:海亞榮生化儀器廠，做水浴鍋用。

2.2 方法與結(jié)果

2.2.1 測定方法掃描驗(yàn)證 取樣品和標(biāo)準(zhǔn)品用蒸餾水配制成濃度約100 μg/mL的溶液，各取2 mL加5 mL2%乙酰丙酮試液和3 mL蒸餾水搖勻，置沸水浴中加熱20 min后流動(dòng)冷卻水冷卻;再加2 mL3%對(duì)二甲氨基苯甲醛酸醇溶液和8 mL無水乙醇搖勻，置60℃水浴中加熱60 min后流動(dòng)冷卻水冷卻，在40 min內(nèi)不同放置時(shí)間后進(jìn)行400～700 nm波長范圍掃描。

結(jié)果一:標(biāo)準(zhǔn)品鹽酸氨基葡萄糖和樣品氨基葡萄糖硫酸鉀在254 nm附近都有明顯的吸收峰，而植物提取物A和植物提取物B沒有吸收峰。見圖7、8、9、10。

圖7 鹽酸氨基葡萄糖掃描圖

圖8 植物提取物A掃描圖

圖9 植物提取物B掃描圖

圖10 氨基葡萄糖硫酸鉀掃描圖

結(jié)果二:標(biāo)準(zhǔn)品在40 min內(nèi)不同放置時(shí)間進(jìn)行掃描其吸收峰及吸收值略有變化，其吸收峰基本在524 nm處，吸收值5到10 min時(shí)有所上升，10 min后逐漸下降，但變化非常小。具體數(shù)據(jù)列于下表2。

表2 不同放置時(shí)間其吸收峰及吸收值的變化

根據(jù)上述結(jié)果，我們決定測定時(shí)，時(shí)間為10 min后，測定波長為524 nm。

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 稱取氨基葡萄糖鹽酸鹽標(biāo)準(zhǔn)品50 mg，定溶于50 mL容量瓶中，濃度為1 mg/mL;然后分別取 0.25、0.50、0.75、1.00、1.25、1.50、1.75 mL定容至10 mL容量瓶，制成濃度為:25μg/mL、50μg/mL ......150μg/mL、175μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)液。分別按下表2順序在各試管中加入各種試劑，流動(dòng)水冷卻置10 min左右后，以“0”管作空白對(duì)照，測定OD250值并填入表2中。以O(shè)D254值為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得標(biāo)準(zhǔn)曲線為:Y(μg/mL)=0.196X－O.004，R=0.997(n=6)。結(jié)果表明實(shí)驗(yàn)中標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度在175 μg/mL內(nèi)與吸收值(λ=254 nm)有線性關(guān)系良好。

表2 試劑加量表

2.3 樣品中氨基葡萄糖含量的測定

2.3.1 樣品配制 精確稱取1.000 g待測樣溶于蒸餾水中，定容于100 mL容量瓶中，于30℃下超聲波溶解30 min，再取1 mL定容于100 mL容量瓶中，待用。各樣品濃度列入下表3。

2.3.2 樣品的測定 分別取各樣品液2 mL代替標(biāo)準(zhǔn)液，按標(biāo)準(zhǔn)曲線制備的方法，測定樣品的OD250值，然后按照標(biāo)準(zhǔn)曲線回規(guī)方程計(jì)算氨基葡萄糖鹽酸鹽含量。然后折算成氨基葡萄糖含量及氨基葡萄糖硫酸鉀含量。結(jié)果如下表3。

表3 樣品中氨基葡萄糖含量

2.4 回收率的測定

精密稱取30、50、70 mg氨基葡萄糖硫酸鉀(純度≥99%)各3份，各加約等量的已測定過氨基葡萄糖含量為零的植物提取物A，加蒸餾水溶解，移至9只100 mL容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度;各取定容液10 mL置100 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，制成含鹽酸氨基葡萄糖分別為30、50、70μg/mL試液各3份。按2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線制備方法顯色后，測定，計(jì)算回收率，結(jié)果見表4。

表4 回收率測定表

3 結(jié)果分析

本方法是利用氨基葡萄糖結(jié)構(gòu)中2一甲基葡萄糖胺在堿性條件下與乙酰丙酮縮合形成生色吡咯，再與對(duì)二甲氨基苯甲醛在酸性條件下結(jié)合成紅色縮合物，在524 nm波長處測定吸收值與標(biāo)準(zhǔn)品比較定量。測定時(shí)，氨基葡萄糖鹽酸鹽含量在170 μg/mL濃度范圍內(nèi)，呈良好線性關(guān)系，R=0.997，平均回收率102.09%。本實(shí)驗(yàn)方法經(jīng)過方法學(xué)的考察，重復(fù)性良好，回收率高，結(jié)果數(shù)據(jù)準(zhǔn)確可靠，方法靈敏、準(zhǔn)確、簡便，可供天可力氨糖膠囊中氨基葡萄糖硫酸鈉含量測定。

［1］ GB/T 20365－2006硫酸軟骨素和鹽酸氨基葡萄糖含量的測定液相色譜法［S］.

［2］ 中華人民共和國衛(wèi)生部.藥品標(biāo)準(zhǔn) 二部(第六冊(cè))［S］.1998:108.

［3］ 孫旭群，楊旭，王效山.N－甲基葡萄糖胺反應(yīng)法測定鹽酸氨基葡萄糖影響因素考察［J］.中國醫(yī)院藥學(xué)雜志，2007，27(10):1478－1479.

［4］ 冉蘭，張榕，文霞，等.比色法測定鹽酸氨基葡萄糖片的含量［J］.華西藥學(xué)雜志，2001，16(3):217 －2l8.

［5］ 韓寶芹，劉萬順，崔麗華，等.昆羧甲基殼聚糖中氨基葡萄糖含量測定方法的研究［J］.中國海洋大學(xué)學(xué)報(bào)，2004，34(5):811－815.

［6］ 趙海珍，姚麗娜.中藥保健品中D－氨基葡萄糖鹽酸鹽含量測定［J］.黑龍江醫(yī)藥，2008，21(5):27－28.