脂聯素基因多態性與2型糖尿病合并冠心病的關聯研究

南 楠 金澤寧* 楊 澤

(1.首都醫科大學附屬北京安貞醫院心血管內科，北京市心肺血管疾病研究所，北京100029; 2.衛生部北京醫院，老年醫學研究所遺傳室，北京100730)

根據美國心臟病協會(American Heart Associa- tion，AHA)2010年的報告［1］，由于積極地進行危險因素的干預，心血管事件的發生率在過去的20年間降低了50%左右，但盡管如此，2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)患者中冠狀動脈粥樣硬化性心臟病(coronary artery disease，CAD，以下簡稱冠心病)的發生率和病死率的絕對危險度仍然是非2型糖尿病者的2倍左右［發病率的風險比(hazard ratio，HR)女性為2.5，男性為2.4，女性患者病死率的HR為2.2，男性為1.7］［1-3］。白種人ADIPOQ基因多態性與2型糖尿病合并冠心病關聯［4-7］。但白種人與中國人有遺傳異質性。本研究探討ADIPOQ基因多態性在中國2型糖尿病人群中與冠心病的關聯。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取2007年2月至2009年5月北京安貞醫院心內科住院患者，冠狀動脈造影結果顯示左主干、左前降支、左回旋支、右冠狀動脈至少1支狹窄≥50%，診斷為冠心病;并且符合1999年WHO糖尿病診斷標準［1］，作為2型糖尿病合并冠心病組，共213例。選取2008年1月至2009年10月衛生部北京醫院內分泌科門診患者符合1999年WHO糖尿病診斷標準［1］且無冠心病病史者，作為2型糖尿病對照組，共467例，獲得所有研究對象知情同意。

1.2 標本采集

清晨空腹排空膀胱后測量身高、體質量、血壓、靜脈空腹血脂、血糖、糖化血紅蛋白(hemoglobin A1c，HBA1c)、尿酸、肌酐、尿素氮等指標，記錄研究對象年齡、性別，留取5 mL EDTA抗凝靜脈血，鹽析法［8］提取DNA。采用Nanodrop ND-1000分光光度計對dsDNA進行質量控制，將所有樣本的dsDNA濃度標化至70～90 ng/μL之間，4℃保存備用。

1.3 預實驗

本研究首先對20例2型糖尿病合并冠心病患者進行ADIPOQ基因第2個外顯子區域測序，測序引物設計應用Oligo 7.0軟件(Molecular Biology Insights，Inc.)，上游引物序列：5'-GAAAGAACCAGCCAAGGAGTGAGA-3'，下游引物序列：5'-GGGAATAGGGATGAGGGTGAAGAT-3'，產物片段長度為1 283 bp，由北京三博遠志生物技術有限責任公司合成。聚合酶鏈式反應(PCR)50 μL體系為：模板10 μL，dNTP 1 μL，TaqDNA聚合酶2.5 μL，10× Buffer 5 μL，上游引物0.5 μL，下游引物0.5 μL，加去蒸餾水至50 μL。在PTC-225PCR儀上進行PCR，其反應條件為：首先95℃預變性5 min后，95℃變性1 min，64.4℃復性30 s，72℃延伸1.5 min，共35個循環，最后72℃延伸7 min。將1 283 bp目的片段用于測序，由北京三博遠志生物技術有限責任公司進行測序。將20例T2DM+ CAD組患者的測序結果與Human(GRCh37)的ADIPOQ基因的序列，應用Megalign軟件的Clustal W方法進行序列拼接，將突變頻率大于0.05的單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphisms，SNPs)作為候選基因的SNPs。

1.4 大樣本量復制研究

將預實驗篩選出的候選SNPs在213例2型糖尿病合并冠心病以及467例單純2型糖尿病患者進行基因頻率分布的比較。基因分型基于高分辨率熔解曲線(high resolution melting，HRM)小擴增子法。

1)引物設計：應用LightScanner引物設計軟件對rs2241766多態性進行引物設計，引物序列為：上游引物：5'-CTGGGAGCTGTTCTACTG-3'，下游引物：5'-CT TGAGTCGTGGTTTCCT-3'。高溫內參：5'-GCGCGGCC GGCACTGACCCGAGACTCTGAGCGGCTGCTGGAGGTG CGGAAGCGGAGGGGCGGGC-3'，低溫內參：5'-TTAAA TTATAAAATATTTATAATATTAATTATATATATATAAA TATAATAC-3'。

2)PCR反應體系(10 μL)：DNA模板1 μL，0.01 mmol/L dNTP 0.2 μL，TaqDNA聚合酶1 U，10×PCR緩沖液1.0 μL，0.01 mmol/L擴增引物0.2 μL(上游引物和下游引物各0.1 μL)，0.01 mmol/L寡核苷酸內參0.2 μL(高溫寡核苷酸內參與低溫寡核苷酸內參各0.1 μL)，LCGreen飽和熒光染料0.8 μL，去離子水6.4 μL補充至總體積為10 μL。

3)反應條件：95℃預變性5 min，95℃變性1 min，58.4℃復性30 s，延伸6 s，共55個循環，72℃總延伸7 min。

4)再進行變性復性處理：95℃30 s，25℃2 min，94℃ 30 s，24℃ 4 min。

5)HRM檢測：LightScanner儀器從45℃開始，以0.3℃/s的斜率采集熔解曲線，至98℃結束，用LightScanner Call IT 2.0軟件對采集后的曲線進行分析，確定基因型。

6)測序驗證：對HRM分析的不同基因型進行測序驗證，以確保結果的準確性。rs2241766T/G多態性的熔解曲線見圖1。

圖1 應用高分辨率熔解曲線分析法檢測rs2241766T/G序列突變Fig.1 Genotyping of rs2241766T/G polymorphism by high resolution melting analysisA：shifted melting peaks，the internal temperature calibrators are designed to melt at 60.33℃(low Cal-1)and 92.0℃(high Cal-1);B：normalized melting peaks.The genotypes(TT/TG/GG)could be clearly distinguished.

1.5 統計學方法

采用SPSS 17.0統計軟件進行統計學處理，計量資料用均數±標準差(±s)表示，組間比較用t檢驗，計數資料以率表示，組間比較用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 預實驗結果

20例極端表型病例(2型糖尿病合并冠心病)和 45例參考數據庫中國漢族北京人的序列拼接比較，在ADIPOQ基因中發現5個SNPs，包括rs17366568G/A、9882205G/A、2241767A/G、1501299G/T、2241766T/ G。以rs2241766T/G多態性為例，其拼接及測序結果見圖2、圖3。各個SNPs位點基因分型結果，見表1。初步預實驗發現2個位點與2型糖尿病合并冠心病關聯，包括rs2241766T/G多態性［OR(95%CI)=2.78(1.20～8.65)，P=0.015］和rs9882205G/A多態性［OR(95%CI)=3.9(1.78～13.61)，P=0.001］。

表1 預實驗中脂聯素基因的5個SNPs分布情況Tab.1 The distributions of 5 SNPs in ADIPOQ gene in pilot study

2.2 基線情況

213例2型糖尿病合并冠心病(病例組)以及467例單純2型糖尿病患者(對照組)臨床基線數據見表2。病例組男性患者比例、體質量指數、收縮壓、舒張壓、總膽固醇、糖化血紅蛋白均高于對照組，而高密度脂蛋白膽固醇(HDL)低于對照組。年齡、肌酐、尿酸、空腹血糖以及低密度脂蛋白膽固醇(LDL)在兩組間差異無統計學意義。

表2 病例組(T2DM+CAD)及對照組(CAD)臨床基線數據Tab.2 Clinical baseline of case group(T2DM+CAD)and control group(T2DM)

2.3 大樣本量復制研究結果

對rs2241766(+45T＞G)多態性進行擴大樣本量的研究。兩組基因型及等位基因分布見表3，2型糖尿病對照組基因型分布觀察值與期望值差異無統計學意義(P＞0.05)，符合Hardy-Weinberg遺傳平衡，說明樣本來自一個隨機婚配平衡狀態的群體，具有代表性。在2型糖尿病患者中，rs2241766多態性與冠心病風險無關。

3 討論

糖尿病是冠心病的高危合并癥［9］。一系列遺傳關聯研究和家族聚集性研究［10-12］表明糖尿病合并冠心病的易感性50%是遺傳因素導致的。脂肪細胞大量地分泌脂聯素，其在2型糖尿病的發生以及冠心病進程中發揮保護作用，通過直接激活AMP激活蛋白酶(AMP kinase，AMPK)通路［13］。脂聯素在糖代謝中主要的作用是通過AMPK途徑激活PPARα，后者增加葡萄糖的攝取并降低肝糖原的輸出。脂聯素在CAD中的保護性效應通過激活心肌細胞AMPK信號通路，并且通過環氧化酶2(cycloxygenase-2，COX2)產生前列腺素E2［14］。Cao Y等［15］發現通過干預直接增加血漿脂聯素水平，可能改善內皮功能，并且降低糖尿病患者心血管合并癥的發生。Fox C S等［3］發現在2型糖尿病患者中，合并冠心病患者血漿脂聯素水平較低。

表3 脂聯素基因rs2242766(+45T/G)多態性在病例組與對照組間分布Tab.3 Comparison of distribution of ADIPOQ rs2241766 (+45T/G)polymorphism in case and control groups

脂聯素(adiponectin，ADIPOQ)基因位于人體第3號染色體3q27區，包括3個外顯子和2個內含子，全長 15.77 kb，編碼區為 4.599 kb。 +45T＞G (rs2241766)位于第2個外顯子，為同義突變，Qi L等［4］發現對于rs2241766而言，G等位基因攜帶者與AA基因型者相比，血漿脂聯素水平無明顯差異。

越來越多的數據［4-7，16-17］表明ADIPOQ基因突變在糖尿病患者中與冠心病相關。但結果卻不盡一致。Lacquemant C等［7］在法國和瑞士的2型糖尿病患者隊列研究中，通過對162例糖尿病合并冠心病病人以及315例糖尿病對照患者比較后發現，無論是2個隊列單獨比較，還是將兩組合并，rs2241766(+45T＞G)與冠心病關聯。與TT純合子相比，GG純合子和GT雜合子組合升高患冠心病的風險(OR=2.0;95% CI：1.3～3.2;P=0.020)。而在之后的研究中，如意大利、日本以及美國糖尿病患者隊列研究［4-6，16］中并未發現rs2241766與冠心病的關聯。馬曉偉等［17-18］在中國人群159例2型糖尿病合并冠心病病例，以及3本研究首先通過對20例擁有極端表型(2型糖尿病合并冠心病)患者進行ADIPOQ基因第2個外顯子測序，結果發現 rs2241766多態性 G等位基因增加T2DM合并CAD風險［OR(95%CI)=2.78(1.20～8.65)，P=0.015］，然而在大樣本量復制研究中未發現rs2241766T/G多態性與T2DM、CAD或T2DM合并CAD關聯的趨勢。與大多數隊列研究結果一致。因此，rs2241766T/G多態性可能不是影響2型糖尿病患者發生冠心病的危險因素。

對于2型糖尿病對照組的選擇差異可能是導致各項研究結果不一致的原因。Lacquemant C等［7］、Bacci S等［6］、Ohashi K等［16］通過心絞痛病史，并且靜息心電圖正常排除冠心病;Qi L等［4-5］則進行前瞻性研究，通過隨訪心血管事件明確或排除冠心病;馬曉偉等［17］則是通過冠狀動脈造影陰性來排除冠心病，但導致對照組樣本量少于病例組;本研究通過冠狀動脈造影明確冠心病而通過無心絞痛病史排除冠心病，而無排除冠心病的客觀證據，可能存在一定誤差。

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